李 影,孫佳明,杜 鶴,劉文叢,張 輝＊

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春 130118)

珍珠母Margaritifera concha為我國常用中藥材,具有平肝潛陽,安神定驚,明目退翳的功效。據(jù)《中國藥典》2010年版記載,珍珠母為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶紋冠蚌 Cristaria plicata(Leach)或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝 Pteria martensii(Dunker)的貝殼。[1]具有平肝、潛陽、定驚、止血的功效,用于治療頭眩、耳鳴、心悸失眠等癥,主要的成分為碳酸鈣,含量在90%以上,有機質(zhì)含3.5%左右,另含少量的鎂、鐵離子、氨基酸。

肽鍵熱振蕩理論認為動物藥材中的蛋白質(zhì)、肽類有效成分經(jīng)熱炮制后,通過分子中肽鍵熱振蕩作用,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變,進而生理活性發(fā)生相應(yīng)的變化。而超微粉碎技術(shù)可在低溫狀態(tài)下進行,并且粉碎速度快,粉碎粒徑達到納米級,有利于保留不耐高溫的生物活性成分及各種營養(yǎng)成分,從而提高藥效。為了分析不同炮制方法對珍珠母蛋白質(zhì)含量及其凝膠電泳特征譜帶的影響,針對珍珠母生品、烘烤品和超微粉樣品,采用考馬斯亮藍法及凝膠電泳技術(shù),試圖從珍珠母不同炮制方法樣品蛋白質(zhì)組成及含量變化的規(guī)律中,為后續(xù)珍珠母炮制工藝研究提供實驗數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物來源 珍珠母Margaritifera concha采集于吉林省大安市嫩江畔月亮湖,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心張輝教授鑒定為淡水雙殼類蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)的貝殼。

1.2 提取分離 珍珠母生品即將干燥的珍珠母粉碎后過60目篩。珍珠母炮制品(烘烤品)即將粉碎后過60目篩的珍珠母生150℃烘箱中烘烤1 h,取出晾干,即可[2]。珍珠母超微粉即將干燥的珍珠母超微粉碎得粉末。3 Kg珍珠粉(生品、超微粉、烘烤品)加入15 000 mL 2mM Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0),4 Co攪拌72 h,4 Co 12 000 r/min離心30min,雙層濾紙抽濾得上清液,0.45 μ m微孔濾膜濾過,超濾分段濃縮≤1 KDa段、≤10 KDa段、>10 KDa段,每段濾液分別合并,凍干[3]。

2 試劑與儀器設(shè)備

2.1 試劑 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0)、醋酸、甲醇 、乙酸 、乙醇 、牛血清白蛋白 、Tris、TEMED 、SDS 、甘氨酸、丙稀酰胺(SIGMA公司)、考馬斯亮藍G-250、溴酚蘭指示劑、2-巰基乙醇、過硫酸銨等。

2.2 儀器設(shè)備 電子天平(MAX=210 g,d=0.001 g)(SARTORIUS AG),pH計(上海虹益儀器儀表有限公司),D5-10型低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),ZFQ-85A型真空濃縮裝置(上海醫(yī)械專機廠),DYCZ-24D型雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠),ECP3000型三恒電泳儀(北京六一儀器廠),凝膠成像儀及分析系統(tǒng)Lab Works4.6(Bionimaging Life Science Research)等。

3 方法

3.1 對照樣品溶液制備 取考馬斯亮藍G-250 100 mg溶于 50 mL 95%乙醇,加入 100 mL 85%H3PO4,用蒸餾水稀釋至1 L,濾紙過濾[4]。

3.2 標準蛋白質(zhì)溶液 結(jié)晶牛血清蛋白(BSA),預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據(jù)其純度用去離子水配制成1.0 mg/mL蛋白溶液10 mL。

3.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL,分別置具塞試管中,各加去離子水至0.1 mL,再分別加入酸性染色液5.0 mL,立即混勻,在595 nm的波長處測定吸光度,同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應(yīng)的吸光度,得測定總蛋白含量的標準曲線回歸方程為Y=33.373X-0.024 4(R=0.999 2)。

3.4 蛋白質(zhì)含量的測定 分別量取珍珠母生品、烘烤品、超微粉蛋白質(zhì)液0.1 mL,加去離子水4.9 mL,混勻,加考馬斯亮藍溶液于595 nm波長處測吸光度,代入標準曲線的線性回歸方程求出含量。

3.5 SDS-PAGE測定珍珠母蛋白的分子質(zhì)量 配制10%分離膠和5%濃縮膠,等膠凝時處理珍珠母蛋白樣品,取適量樣品放EP管中,加入SDS(未加DTT)后加巰基乙醇(15～20 μ L)混勻,100 ℃水浴加熱 3～5 min。將處理好的珍珠母樣品15 μ L加入到凝膠孔中,連接電泳儀,打開電源,調(diào)整電壓70 V開始電泳,大約25 min后溴酚蘭指示開始進入濃縮膠后,將電壓調(diào)至120 V,待指示劑溴酚蘭到達膠的底部距離下緣0.5 cm時停止電泳,把凝膠取出,脫色直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止。[5]

4 結(jié)果

4.1 蛋白質(zhì)濃度測定 按“1.2”項下制備樣品,分別取珍珠母生品、烘烤品超微粉,按“3.4”項下計算得珍珠母生品總蛋白含量為29 ng/g,烘烤品總蛋白含量為23.15 ng/g,超微粉總蛋白含量為33.28 ng/g。由此可以得出珍珠母生品,烘烤品,超微粉總蛋白含量依次升高,超微粉總蛋白含量最高。

4.2 珍珠母蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定結(jié)果 SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果,根據(jù)標準蛋白的遷移距離計算出相對遷移率,得到珍珠母蛋白分子量的大小。

珍珠母生品總蛋白的4個條帶的相對分子質(zhì)量分別是50.8、41.923、38.693、23.317 KDa;烘烤品總蛋白的4個條帶的相對分子質(zhì)量分別是 51.017、41.923、38.693、23.124 KDa;超微粉總蛋白的 4 個條帶的相對分子質(zhì)量分別是 51.017、41.744、38.373、23.511 KDa。

5 討論

本實驗將炮制方法不同的珍珠母總蛋白利用閃蒸濃縮并凍干,凍干粉通過考馬斯亮藍法比較,發(fā)現(xiàn)珍珠母超微粉總蛋白含量最大,而烘烤品、生品的依次降低。進而應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳對3種總蛋白進行分析,結(jié)果它們條帶數(shù)目基本一致,說明蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布基本相同,經(jīng)計算珍珠母總蛋白中4個條帶的相對分子質(zhì)量分別約為 23.3、38.6、41.9、51.0 KDa;生品、烘烤品和超微粉各條帶平行比較時顏色依次加深,說明其蛋白含量依次升高,這與前面考馬斯亮藍法測定含量結(jié)果相附。尤其明顯的是生品在相對分子質(zhì)量23.3 kDa條帶顏色極淺,烘烤品和超微粉顏色明顯加深,依據(jù)肽鍵熱振蕩理論,說明珍珠母烘烤品在炮制加熱過程中,組織疏松,有效成分易于溶出,且某些大蛋白肽鍵斷裂使相對分子質(zhì)量23.3 kDa的蛋白含量增加;而超微粉粉碎度增加,發(fā)生了物理變化,使蛋白質(zhì)溶出率極大提高。以上結(jié)果提示現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)完全可以作為新的炮制方法來取代貝殼類藥材的傳統(tǒng)熱炮制工藝,這為中藥現(xiàn)代炮制理論進行了有益的補充。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2]梁衛(wèi),勞家和.中藥馬氏珍珠母炮制方法初探[J].中藥材,1988,11(3):34-35.

[3]張芩.合浦珠母貝貝殼形成相關(guān)蛋白及基因的研究[D].北京:清華大學(xué),2006.

[4]王孝平,邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3):40-42.

[5]汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2000:90-103.