張憲偉，徐靜茹，曹波

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，江蘇南京 210008)

肝豆狀核變性又稱Wilson病(WD)是目前少數(shù)可治療的遺傳代謝性疾病之一，其診斷主要依賴于實驗室檢查，尿銅是最常用的診斷指標之一[1-3]。尿液中的銅元素因含量低，基本成分復(fù)雜，個體差異較大，測定方法在靈敏度、準確度、抗干擾力和穩(wěn)定性等方面要求較高。目前國內(nèi)尿銅檢測方法主要是采用原子吸收分光光度計火焰法(AAS)，該方法儀器簡單，線性范圍窄，重現(xiàn)性較差，受外界干擾因素影響大。本研究基于電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)具有較高的精密度與準確度，符合實驗室尿銅檢測標準化的需求。

1 材料方法

1.1 標本

尿液標本:來自南京市兒童醫(yī)院檢驗科，采用濃硝酸5 ml防腐，收集3個不同尿銅濃度標本(2009-1N、2009-2N、2009-3N)24 h尿量，留取30 ml尿液樣本待檢。尿液標本外觀清亮，尿常規(guī)檢測結(jié)果正常，除外黃疸尿、乳糜尿等異常樣本，同時收集我院就診的100名體檢兒童尿液作為正常對照。

1.2 儀器及實驗器材

1.2.1 儀器 法國JY公司ULTIMA-2型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀，按儀器操作規(guī)程進行檢測。

1.2.2 實驗器材 所有與試劑、水、稀釋液或樣本接觸的玻璃或塑料器材按下列步驟清洗:(1)使用常規(guī)清洗程序(含去污劑熱水浸泡，自來水沖洗);(2)在30%硝酸中浸泡過夜;(3)去離子水沖洗5～10 min;(4)無塵環(huán)境中倒置自然干燥。

實驗條件:環(huán)境溫度20～25℃，濕度20%～50%，電壓波動＜5%，氬氣純度99%，循環(huán)冷卻水溫23℃。儀器高頻發(fā)生器頻率40.68 MHz，高頻輸出功率0.95 kW，反射功率 ＜5 W，載氣流量1.0 L·min－1，等離子氣流量 12 L·min－1，護套氣流量 0.2 L·min－1，提升量 1 ml·min－1，輸入狹縫 20，輸出狹縫 15，觀測高度 10 mm，積分時間 5 s[4]。

Milli-Q凈化水裝置:密里博中國有限公司生產(chǎn)。用于實驗室去離子水制備。去離子水:(≥15 MΩ·cm－1)，供試劑配制和器皿沖洗。

DRAGON-MED移液器:南京市計量局每年1次強檢，廠家每年校準1次，每月1次內(nèi)校正。

1.3 試劑

美國SPEX公司，銅元素標準液。質(zhì)控品:美國SPEX公司，多元素質(zhì)控物。濃硝酸:南京化學(xué)二廠，優(yōu)級純。

1.4 AES尿銅檢測操作程序

(1)擇銅的檢測共振線324.754 nm，保證儀器穩(wěn)定，重復(fù)檢測同一空白液發(fā)射光強度，保證相對偏差(RSD)＜2。

(2)測定0、10、20、50、100 μg·L－1質(zhì)量濃度的銅標準液，儀器自動繪制標準曲線，并對空白液進行20次測定，儀器自動計算檢出限。

(3)質(zhì)控樣品分析，樣本重復(fù)3次，RSD＜2，取均值。

(4)尿液樣本分析，尿液標本用去離子水稀釋5倍，每份樣本重復(fù)測定3次，RSD＜2，取均值;每檢測5份樣本，插入1份質(zhì)控樣本，并保證整個檢測過程中質(zhì)控樣本變異RSD＜2。

2 結(jié) 果

2.1 精密度

將分裝好的2009-1N、2009-2N、2009-3N尿液標本，每日取出1瓶測定，每瓶為1批，各檢測6批，每批標本重復(fù)檢測3次，計算批內(nèi)CV、批間CV和總CV。結(jié)果見表1。

表1 ICP-AES測定尿銅的精密度

2.2 回收率

取1份體檢尿液標本，分裝5管，每管5 ml，其中1管做空白，另4管分別加入銅質(zhì)量濃度為62.5、125、250、500 μg·L－1的標準品，測定其回收率。見表 2。

表2 ICP-AES測定尿銅的回收率

2.3 靈敏度檢測

檢測靈敏度是標準曲線的斜率。以發(fā)射光強度為Y，濃度為X，回歸方程Y=25 385X+16 577，r=0.999 8。見圖1。

圖1 尿銅的標準曲線

2.4 檢出限測定

測量空白液20次的發(fā)射光強度，儀器會自動計算出樣品的最低檢出限0.004 2 μg·L－1。根據(jù)測量空白液20次的發(fā)射光強度的標準差的3倍所對應(yīng)的樣品濃度為檢測限的原則[5]。

2.5 干擾實驗

標本收集時，采用5 ml濃硝酸作為尿液防腐劑。為了檢測濃硝酸對尿銅檢測的影響，分別定容50 ml的 500、1 000、2 000 μg·L－1的質(zhì)控液中加入濃硝酸1.25 ml，檢測加入硝酸與未加硝酸質(zhì)控液中銅的含量，見表3。

表3 濃硝酸干擾試驗?zāi)蜚~檢測結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，加入濃硝酸前后銅元素含量改變不明顯。

因為ICP-AES分辨率可達0.01 nm，尿中的低濃度元素不會對銅的測定產(chǎn)生干擾。采用尿中濃度較高的鉀、鈉、氯進行干擾實驗，即在水空白溶液中按1∶1分別加入25 mg·L－1鉀、鈉、氯的標準品溶液，測定銅含量，實驗結(jié)果顯示空白溶液中加入干擾元素后，未檢測出銅含量的明顯變化。

2.6 兒童尿銅參考值范圍

檢測我院就診100名體檢兒童尿液銅，正常值范圍(36.42 ±6.78)μg·L－1。見表4。

表4 100名健康體檢兒童尿銅含量

3 討 論

臨床對尿銅測定結(jié)果的準確度與精密度要求較高。尿銅檢測首先要考慮的是結(jié)果的可靠性，其次考慮自動化、高效性、樣本微量化等因素[6]，批間精密度≤8%。ICP-AES檢測3個不同水平的尿液標本，批間精密度≤5%，滿足建立測量程序的要求。

影響ICP-AES準確度和精密度的因素很多，主要有定標溶液的準確性、儀器及環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)等。在標準液配制過程中嚴格遵守操作規(guī)程，避免容量瓶等實驗器材和水的污染，保證操作環(huán)境穩(wěn)定。有實驗表明，儲存超過3 d的空白液，其發(fā)射光和吸光強度都會明顯增加[7]，所以空白工作液和定標液均現(xiàn)配現(xiàn)用，以減少試劑對實驗的影響。

實驗結(jié)果顯示，濃硝酸作為尿液標本的防腐劑，對檢測結(jié)果無影響。有實驗證實，絕大多數(shù)陰離子，如硝酸、草酸等酸根離子對尿銅的影響不大。本實驗中發(fā)現(xiàn)，部分尿液標本中由于含較高濃度的鈉離子和氯離子，高溫下會在炬芯內(nèi)壁上形成大量固體晶體，導(dǎo)致儀器的火炬熄滅，所以我們采用去離子水稀釋尿液標本檢測。經(jīng)實驗證實，對尿液標本以 1∶2、1∶5、1∶10 的稀釋對檢測結(jié)果的影響甚微，考慮到檢測樣本的系檢測的吸樣量和發(fā)射光量，選擇1∶5作為尿液稀釋的倍數(shù)，故本實驗采用直接稀釋法檢測。

ICP-AES對檢測環(huán)境要求較高，主要包括電壓、溫度、氬氣純度、排風(fēng)、濕度、循環(huán)冷卻水溫等。溫度和濕度對其檢測結(jié)果影響較大，環(huán)境溫度 ＞30℃及濕度＞80%，檢測峰會出現(xiàn)明顯漂移。此外，循環(huán)水溫＞30℃亦會明顯影響發(fā)生器功率的穩(wěn)定，使得定標結(jié)果和檢測結(jié)果出現(xiàn)漂移(＞2 RSD)。檢測前，儀器點火成功后應(yīng)穩(wěn)定半小時以上，輸出功率穩(wěn)定在1.0 kW，反射功率＜5 W。

ICP-AES測定尿銅的方法具有準確度高、精密度高、檢出限低、費用低的優(yōu)點。同時，實驗不需要常規(guī)的消化處理設(shè)備，減少了試劑的用量和預(yù)處理的時間，因此建議作為臨床測定尿銅的常規(guī)檢測方法。

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