劉大剛　楊芳　佘沅軒　李嬋

【摘要】目的：探討乳腺癌中微血管密度（MVD） 與轉(zhuǎn)移.預(yù)后.組織學(xué)分型的關(guān)系，MVD采用內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記（CD34）或血管內(nèi)皮因子（VⅢ因子）標(biāo)記的可行性。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision二步法（Dako EnVisionTM Kit）標(biāo)記 CD34、Ⅷ因子檢測乳腺癌MVD。結(jié)果VⅢ因子標(biāo)記116例乳腺癌的MVD平均值是12.88±2.51，CD34 標(biāo)記116例乳腺癌MVD平均值是13.45 ±2.74，MVD值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（p<0.01）；Ⅷ因子標(biāo)記的MVD值與CD34 標(biāo)記的MVD值呈正相關(guān)（F檢驗(yàn)的結(jié)果為；F>>F0.99 （1，114）；MVD值與五年生存期呈負(fù)相關(guān)（p<0.01），MVD值與組織學(xué)類型無關(guān)（p<0.05）。結(jié)論 乳腺癌MVD值與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生存期關(guān)系密切，可以作為一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)；MVD值既可以用CD34 標(biāo)記又可以用Ⅷ因子標(biāo)記。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；轉(zhuǎn)移；組織分型；預(yù)后；免疫組織化學(xué)

【中圖分類號(hào)】R271.44【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1004-4949（2013）09-42-03

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病[1]。近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后與微血管數(shù)（microvessl density，MVD）有關(guān)，但是有關(guān)乳腺癌MVD與其預(yù)后關(guān)系，目前仍存在爭議，一些研究認(rèn)為微血管數(shù)定量可以作為乳腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo)[2-8]。也有人認(rèn)為MVD不能預(yù)測癌的復(fù)發(fā)與預(yù)后[9]。為此，我們采用血管內(nèi)皮因子（Ⅷ因子）和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記（CD34）檢測116例乳腺癌的MVD，并對(duì)有完整隨訪資料的46例進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討乳腺癌MvD值與轉(zhuǎn)移、預(yù)后組織學(xué)分型的關(guān)系，以期更好地為臨床治療和判斷預(yù)后提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1標(biāo)本來源：所有病例選自昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，按下列程序和方法篩選病例。（1）選自 2002～2012年間行乳腺癌根治術(shù)和改良根治術(shù)的116例，其中46例有完整的隨訪資料，從術(shù)后隨訪到死亡，存貨病例隨訪5年以上未見復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移征象，最長達(dá)10年。（2）有腫瘤原發(fā)灶蠟塊保存。（3）對(duì)乳腺癌組織類型按照WHO進(jìn)行分類。（4）作為Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34檢測。116例患者均為女性，年齡29～83歲，平均為44.5歲；手術(shù)時(shí)無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例（其中有隨訪資料的21例中，5年內(nèi)死亡的為6例）；手術(shù)時(shí)無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者70例（其中有隨訪資料的25例中，5年內(nèi)死亡的為1例，5年后尚未死亡的10例）；在46例有完整的隨訪資料的病例中，有29例為手術(shù)后未滿5年而且尚未死亡者。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和方法：用常規(guī)石蠟切片做Ⅷ因子和CD34檢測，一抗為鼠抗人單克隆抗體（Kit-9701），工作濃度為即用型，監(jiān)測系統(tǒng)為：鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒（Dako EnVisionTM 二步法Kit，丹麥基因生物技術(shù)開發(fā)公司），按說明書操作方法進(jìn)行，顯色劑為DAB。

1.3Ⅷ因子、CD34標(biāo)記的MVD值：指癌巢間及癌巢周圍染棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個(gè)血管標(biāo)記，參照Bosasi[6]和Kolkman[7]的標(biāo)準(zhǔn)，在400倍的視野下選擇微血管數(shù)最多的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每例切片先后計(jì)數(shù)兩次，求平均值。

1.4組織學(xué)分型方法：根據(jù)組織發(fā)生和形態(tài)結(jié)構(gòu)將乳腺癌分為導(dǎo)管癌、小葉癌和特異性癌三大類。

1.5將Ⅷ因子和CD34標(biāo)記的MVD用線性回歸分析檢測她們的相關(guān)關(guān)系。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各組數(shù)據(jù)平均值采用X±S表示，用T檢驗(yàn)，線性回歸采用F檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1用Ⅷ因子標(biāo)記的116例乳腺癌患者的MVD平均值是12.88±2.511，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46例乳腺癌患者的MVD平均值是14.51±2.67，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的70例乳腺癌患者的MVD平均值為11.80±1.70，兩者相差顯著（p<0.01），MVD值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；5年內(nèi)死亡者M(jìn)VD值為15.14±1.79，存活5年以上者M(jìn)VD值為11.32±1.07，兩者相差顯著（p<0.01），且與5年以上生存期呈負(fù)相關(guān)；組織學(xué)分型與MVD無顯著性差異（p>0.05）.

2.2用CD34標(biāo)記的116例乳腺癌患者的MVD平均值是13.45±2.74，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46例乳腺癌患者的MVD平均值是15.47±2.67，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的70例乳腺癌患者的MVD平均值是12.12±1.83.兩者相差顯著（p<0.01），MVD值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；5年內(nèi)死亡者M(jìn)VD值為15.74 ±1.62，存活5年以上者M(jìn)VD值為12.02±1.22，兩者相差顯著（p<0.01），也與5年以上生存期呈負(fù)相關(guān)；組織學(xué)分型與MVD無顯著性差異（p>0.05）.

2.3116例乳腺癌患者，采用Ⅷ因子和CD34標(biāo)記的MVD值之間呈顯著線性正相關(guān)（F=97.7，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F0.99（1，114）+6.96），其線性回歸方程式：y=4.54+0.62x（注x代表CD34表達(dá)的MVD值，y代表Ⅷ因子表達(dá)的MVD值），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見附表。

附表MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5年生存期、組織學(xué)分型的關(guān)系

MVQ的表達(dá)1分組1例數(shù)1MVD（個(gè)，X±S）1T值1P值Ⅷ因子

2討論

乳腺癌是中年婦女最常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差，其中血行和淋巴的轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。因此，迫切需要尋找一種簡單可行的以預(yù)測乳腺癌的轉(zhuǎn)移及判斷愈后指標(biāo)，輔助指導(dǎo)臨床的治療。為此我們重點(diǎn)觀測乳腺癌的腫瘤性血管生成與患者預(yù)后的關(guān)系，及腫瘤微血管密度與乳腺淋巴一血路轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

現(xiàn)已研究表明，實(shí)體腫瘤的生長是血管依賴性的，血管作為腫瘤間質(zhì)中的一種重要成分與腫瘤細(xì)胞互相作用，構(gòu)成完整的微生態(tài)系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（BFGF）促成血管生成；而血管內(nèi)皮細(xì)胞也可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和加速增殖[10]，微血管生成還與浸潤性腫瘤內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞以及活化的淋巴細(xì)胞有關(guān)[7].由于新生的微血管發(fā)育不成熟，管壁僅為一層常有裂隙的內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏基底膜，但又由于內(nèi)皮細(xì)胞分泌的纖維蛋白溶解酶的作用，使腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入微血管，經(jīng)血循環(huán)在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶[4，6，7].另一方面，微血管形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞要產(chǎn)生多種基質(zhì)降解酶，也可破壞基質(zhì)屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，本組116例乳腺癌患者中，有淋巴結(jié)及其他臟器轉(zhuǎn)移者46例，無轉(zhuǎn)移者70例，有轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)VD值顯著大于無轉(zhuǎn)移患者的MVD值（p<0.01）.由此可見微血管生成可能是包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要標(biāo)志物。

腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是造成患者死亡的重要原因之一，無論原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移瘤的形成和生長，均依賴于血管形成，因此，血管生成數(shù)越多，腫瘤生長速度越快，轉(zhuǎn)移幾率越高[10～12]。本組有隨訪的46例病人中，5年內(nèi)死亡的7例，存活5年以上的10例，存活者的MVD值顯著的小于死亡者的MVD值（p<0.01）。即微血管密度越大生存期越短，微血管密度越小生存期越長。因此，我們有理由提出，對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行MVD標(biāo)記檢測，將可能成為判斷惡性程度及其預(yù)后的一本指標(biāo)，但是由于隨訪5年生存及5年死亡的例數(shù)較少，尚有待進(jìn)一步積累資料深入研究。研究中發(fā)現(xiàn)組織類型與血管生成數(shù)沒有相關(guān)性。

在本研究中，我們采用人原始造血細(xì)胞抗原CD34 （human hematopietic progenitor cell antige CD34 ），顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞。該抗體染色強(qiáng)度深，且背景清晰，而且對(duì)癌內(nèi)微血管，以及尚未形成的管腔的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，均有較強(qiáng)的染色（圖1），有利于準(zhǔn)確計(jì)算MVD值。另外，我們還采用血管內(nèi)皮相關(guān)抗原Ⅷ因子標(biāo)記微血管，以及尚未形成的管腔的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖2），兩者檢測血管的結(jié)果基本一致，但我們認(rèn)為CD34標(biāo)記優(yōu)于Ⅷ因子，若兩者染色相結(jié)合觀察所得之結(jié)果更準(zhǔn)確。

目前有些研究表明，使用血管抑制劑治療實(shí)體瘤已經(jīng)取得了顯著的臨床效果。本研究結(jié)果不僅表明MVD與乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)，也為乳腺癌的病人抗新生血管的形成治療提供了治療依據(jù)。

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