張海瑛　韓宜姚

[摘要] 目的 探討EV71感染手足口病患兒細(xì)胞免疫及體液免疫功能變化。 方法 將92例EV71感染的手足口病患兒分為重型組、輕型組，另選正常健康對(duì)照組兒童30例為對(duì)照組，檢測(cè)各組靜脈血T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞表達(dá)情況，免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4水平及TNF-α、IL-6及IL-10水平。 結(jié)果 重型組及輕型組患兒Th及Ts細(xì)胞比例降低，B細(xì)胞比例升高，TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，IgA、IgG、C3、C4水平升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 EV71感染手足口病患兒存在細(xì)胞及體液免疫異常情況，并且同病情相關(guān)，臨床檢測(cè)有助于病情預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估。

[關(guān)鍵詞] 腸道病毒71；手足口病；細(xì)胞免疫；體液免疫；免疫球蛋白

[中圖分類號(hào)] R725.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）09-0028-03

手足口病是由腸道病毒感染引起的常見的小兒傳染病，多由腸道薩科奇A型病毒及EV71病毒感染引起，具有較高的傳染性，是我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)控的小兒傳染病之一。患兒感染后病毒繁殖引起病毒血癥，并且對(duì)組織及器官具有侵襲性，引發(fā)患兒的多器官功能損傷，甚至引起功能衰竭，在手、足口等黏膜部位及組織受壓部位，病毒容易聚集、繁殖引起局部組織病變，表現(xiàn)為典型的臨床癥狀，手、足及皮膚黏膜損害。近年來的研究結(jié)果顯示[1，2]，在大部分病毒感染疾病中，體液免疫及細(xì)胞免疫均參與疾病的進(jìn)展及組織損傷過程，本研究就EV71感染致病的手足口病患兒體內(nèi)細(xì)胞免疫及體液免疫功能的變化進(jìn)行研究，為EV71感染手足口病患兒的臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院兒科2010年2月～2012年3月診斷并治療的EV71病毒感染致病的手足口病患兒92例，患兒年齡0.6～7.8歲，平均（3.2±1.6）歲，其中男52例，女40例，患兒均經(jīng)PCR核酸檢測(cè)明確診斷，病程1～5 d，平均（3.2±1.1）d，并排除使用免疫抑制劑治療、患有結(jié)核、其他病毒感染性疾病及免疫疾病患兒，患兒入選后按《手足口病診療指南（2010）》標(biāo)準(zhǔn)分為輕型組及重型組[3]，其中輕型組38例，男22例，女16例，年齡0.6～7.6歲，平均（3.1±1.7）歲，病程2～5 d，平均（3.5±1.3）d，重型組54例，其中男30例，女24例，年齡0.6～7.8歲，平均（3.2±1.5）歲，病程1～5 d，平均（3.0±1.2）d，對(duì)照組兒童30例，其中男18例，女12例，年齡1～9歲，平均（3.7±1.8）歲，三組間性別比例、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

1.2 試劑及儀器

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.1 血清炎性介質(zhì)檢測(cè) 各組血清炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6及IL-10檢測(cè)采用比色法，患兒抽取清晨空腹靜脈血，低溫離心血清，超低溫冰箱保存，分批檢測(cè)，檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，蒸餾水空白對(duì)照，721型分光光度計(jì)檢測(cè)各管吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為樣品濃度，血清標(biāo)本解融后梯度稀釋至檢測(cè)范圍，采用微量加樣器，48孔板每孔加入100 μL標(biāo)本，以蒸餾水作為空白對(duì)照，各組標(biāo)本加入檢測(cè)試劑盒抗體，室溫孵育30 min，依次加入X Biotin和X HRP，充分混勻，加入TMB室溫孵育15 min顯色，采用稀硫酸終止反應(yīng)，分光光度計(jì)測(cè)量各孔吸光度，繪制檢測(cè)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各檢測(cè)樣品檢測(cè)物濃度。

1.3.2 IgA、IgG、IgM及C3、C4檢測(cè) IgA、IgG、IgM及C3、C4檢測(cè)采用放射免疫法，清晨采集空腹靜脈血，低溫離心得血清，深低溫冰箱保存，標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度稀釋，依次計(jì)入一抗及I131標(biāo)記的二抗后室溫孵育，采用放射免疫 γ 計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)本解融后按照上述步驟進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，繪制檢測(cè)物曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)標(biāo)本濃度。

1.3.3 T細(xì)胞及B細(xì)胞檢測(cè) 患兒清晨抽取空腹靜脈血，加入流式細(xì)胞儀專用紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫震蕩，加入淋巴細(xì)胞分離液，室溫震蕩20 min，低速離心淋巴細(xì)胞，棄去上清液，淋巴細(xì)胞加入PH值為7.0的PBS緩沖液充分洗滌，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)管獲取1000個(gè)細(xì)胞，采用CD3+抗體標(biāo)記T細(xì)胞，采用CD4+抗體標(biāo)記Th細(xì)胞及Ts細(xì)胞，采用CD19+抗體標(biāo)記B淋巴細(xì)胞，檢測(cè)完畢后采用Cellquestpro軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 討論

手足口病是病毒感染引起的常見兒童傳染病，手足口病多發(fā)病隱匿，傳染性強(qiáng)，多種腸道病毒感染均可引起手足口病，除典型的皮膚及神經(jīng)系統(tǒng)損害以外，多具有多器官損害的特征，如心肌損害等，重型者死亡率較高，既往研究發(fā)現(xiàn)，在手足口病患兒血清及體液中免疫因子及炎性因子表達(dá)異常，提示可能免疫過程參與手足口病的發(fā)病及進(jìn)展過程，而且在手足口病患兒體內(nèi)存在Th細(xì)胞免疫漂移現(xiàn)象，Th1向Th2亞群分化導(dǎo)致的免疫抑制是手足口病患兒病情進(jìn)展的機(jī)制之一[4.5]。

多種血清型的腸道病毒感染均能引起手足口病，其中EV71感染所致的手足口病是常見的類型之一，在對(duì)EV71感染所致的手足口病患兒研究發(fā)現(xiàn)，在患兒體內(nèi)存在細(xì)胞免疫及體液免疫異常情況，患兒感染手足口病后，其體內(nèi)的Th及Ts淋巴細(xì)胞的數(shù)量均明顯下降，B細(xì)胞數(shù)量升高[6]。Th細(xì)胞具有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化及應(yīng)答的作用，是機(jī)體維持正常細(xì)胞免疫的主要機(jī)制之一[7.8]。Ts細(xì)胞對(duì)Th的活化及B細(xì)胞活化具有調(diào)節(jié)作用，Th及Ts細(xì)胞與患者細(xì)胞免疫關(guān)系最為密切，Th及Ts細(xì)胞的下降說明患者細(xì)胞免疫功能受到抑制。而且與患兒手足口病的病情程度相關(guān)，重癥組患兒細(xì)胞免疫抑制情況更為明顯[9，10]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在手足口病患兒體內(nèi)存在過度炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，TNF-α、IL-6 及IL-10過度表達(dá)，TNF-α、IL-6 及IL-10均是由活化的免疫細(xì)胞釋放的介質(zhì)，TNF-α和IL-6具有強(qiáng)烈的導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的作用，能夠?qū)е陆M織、器官的炎性損傷甚至功能衰竭、組織壞死，同時(shí)TNF-α和IL-6對(duì)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞具有趨化及激活作用，能夠?qū)е戮植垦仔约?xì)胞的聚集及炎癥反應(yīng)，IL-10主要有Th2細(xì)胞、B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子，是對(duì)T細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的炎性因子，能夠反饋性抑制Th2細(xì)胞的表達(dá)，調(diào)節(jié)Th細(xì)胞免疫平衡及抑制過度的免疫反應(yīng)，IL-10的過度表達(dá)提示患者體內(nèi)存在Th2細(xì)胞的過度表達(dá)及漂移現(xiàn)象，說明存在細(xì)胞免疫的異常。

免疫球蛋白可使補(bǔ)體成分激活及體液免疫增強(qiáng)，研究中發(fā)現(xiàn)，患兒體內(nèi)的IgA、IgG水平及補(bǔ)體C3、C4水平明顯升高。IgA、IgG的表達(dá)水平升高說明機(jī)體的體液免疫功能增強(qiáng)。IgA、IgG對(duì)巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的免疫吞噬作用具有增強(qiáng)作用，IgA尚能夠通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，C3、C4等補(bǔ)體是體內(nèi)正常表達(dá)的肽類分子，通過B細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)抗原的提呈作用激活，引起對(duì)外來抗原的識(shí)別及結(jié)合，參與機(jī)體的非特異性免疫[11]，研究結(jié)果顯示，手足口病患兒存在體液免疫亢進(jìn)的情況，而且同病情相關(guān)，重癥患兒表現(xiàn)更為明顯，其可能是手足口病患兒機(jī)體防御的主要表現(xiàn)[12]。既往研究顯示[13]，在手足口病患兒的早期病程中IgM升高，病程第2天以后，IgM的升高的檢出率明顯下降，在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)IgM在手足口病患兒中無明顯變化，可能同患兒的病程有關(guān)[14，15]。研究結(jié)果顯示，手足口病患兒細(xì)胞免疫功能抑制，體液免疫功能激活，同患兒的疾病進(jìn)展程度相關(guān)，其主要原因可能與患兒病情進(jìn)展及康復(fù)的過程體內(nèi)免疫異常有關(guān)。

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（收稿日期：2013-01-22）