鄒濤 劉先利 黃衛(wèi)東等

摘要：研究了重金屬Cd2+、Hg2+和Pb2+對膨脹腎形蟲（Colpoda inflata）的毒性效應(yīng)。在3種重金屬離子作用下，膨脹腎形蟲的生長受到明顯的抑制，對膨脹腎形蟲的毒性從大到小依次為Hg2+、Pb2+、Cd2+。聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種重金屬離子的不同配比下，聯(lián)合作用類型和強(qiáng)度有一定的差異。Cd2+-Pb2+在濃度比1∶1和毒性比1∶1時均為拮抗作用；Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1時為協(xié)調(diào)作用，毒性比1∶1時先表現(xiàn)為拮抗作用后表現(xiàn)為協(xié)同作用； Hg2+-Cd2+在濃度比1∶1時為協(xié)同作用，毒性比1∶1時為拮抗作用； Cd2+-Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1∶1時均為協(xié)同作用，毒性比1∶1∶1時由拮抗作用逐漸轉(zhuǎn)為協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：重金屬離子；膨脹腎形蟲；急性毒性；聯(lián)合毒性

中圖分類號：X171 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1556-05

纖毛蟲是由單細(xì)胞構(gòu)成的完整的生命體，具有生長、呼吸、代謝、排泄等一切生命活動。纖毛蟲與它們所在的環(huán)境密切接觸，能對外界環(huán)境的變化做出敏捷的反應(yīng)，且絕大多數(shù)纖毛蟲種類為世界性分布，不受季節(jié)和地區(qū)差異的限制，因此在環(huán)境污染監(jiān)測中具有不可替代的作用[1-3]。在20世紀(jì)初，水生纖毛蟲就開始應(yīng)用于淡水生態(tài)系統(tǒng)的監(jiān)測中，目前水生纖毛蟲作為指示生物已廣泛用在淡水水環(huán)境的污染指示與評價中[4-7]，而對土壤纖毛蟲重金屬毒性狀況的研究，尤其是重金屬聯(lián)合毒性的研究并不多見。

作為礦業(yè)資源枯竭型城市，黃石市正處于城市經(jīng)濟(jì)發(fā)展轉(zhuǎn)型期，其土壤中存在的大量重金屬離子嚴(yán)重影響該地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)，礦區(qū)土地的修復(fù)與利用已成為經(jīng)濟(jì)發(fā)展的瓶頸。選擇廣泛存在于自然環(huán)境的膨脹腎形蟲為受試生物，黃石市土壤中常見的金屬Cd、Pb和Hg為毒物，通過單一毒性實(shí)驗(yàn)得出半數(shù)抑制濃度（IC50），為更準(zhǔn)確地評價重金屬對土壤微生物的毒性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。在單一毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究3種金屬離子對膨脹腎形蟲的聯(lián)合毒性效應(yīng)，對重金屬污染土壤的再利用、環(huán)境質(zhì)量評價及生態(tài)修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 蟲種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的材料為腎形目膨脹腎形蟲（Colpoda inflata），采自湖北理工學(xué)院后山，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室用Pringsheim′s 液大量培養(yǎng)繁殖，選取生長狀態(tài)良好的個體分離后在室溫下以土壤浸出液為培養(yǎng)液，以米粒繁殖細(xì)菌為餌料，建立克隆培養(yǎng)。土壤浸出液的配制是取300 g土壤加入蒸餾水1 000 mL，煮沸10 min，冷卻后用紗布過濾去除沉渣，再用濾紙過濾制得[8]。CdSO4·8H2O、Pb（CH3COO）2·3H2O、HgCl2均為分析純試劑，用蒸餾水配制成200 mg/L母液，實(shí)驗(yàn)時稀釋成所需要的濃度。

1.2 預(yù)備實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入1.5 mL的重金屬培養(yǎng)液，再加入0.5 mL的土壤纖毛蟲母液。以10倍之差估算5個濃度梯度，處理24 h，分別找到Cd2+、Pb2+和Hg2+的100%抑制濃度和無抑制濃度。

1.3 單一金屬離子毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)5個濃度組和1個對照組，同時設(shè)2個平行組，分別在24、48、72和96 h記錄1 mL培養(yǎng)液中膨脹腎形蟲的個數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)2次。根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各種重金屬離子的正式單一毒性實(shí)驗(yàn)濃度：Cd2+為1.90、3.00、4.80、7.60、12.00 mg/L；Pb2+為2.40、3.80、6.00、9.50、15.00 mg/L；Hg2+為0.20、0.26、0.32、0.40、0.50 mg/L。

1.4 兩種金屬離子聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

在單一毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按濃度比1∶1和毒性比1∶1進(jìn)行Cd2+-Pb2+、Pb2+-Hg2+、Cd2+-Hg2+共存下的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)。濃度比1∶1時，兩種金屬離子在土壤浸出液中的濃度分別為：Cd2+-Pb2+，1.30、2.00、3.20、5.00、7.90 mg/L；Pb2+-Hg2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L； Hg2+-Cd2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L；毒性比1∶1時，以48 h IC50值為一毒性單位，相應(yīng)的毒性單位為0.30、0.38、0.49、0.63、0.80。

1.5 3種金屬離子的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

按濃度比1∶1∶1和毒性比1∶1∶1進(jìn)行Cd2+-Pb2+-Hg2+共存下的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)。濃度比1∶1∶1時，Cd2+-Pb2+-Hg2+在土壤浸出液中濃度分別為0.05、0.08、0.13、0.20、0.32 mg/L；毒性比1∶1∶1時，以48 h IC50 值為一毒性單位，3種溶液的混合按照0.17、0.21、0.26、0.33、0.42倍48 h IC50值進(jìn)行，相應(yīng)的毒性單位為0.51、0.63、0.78、0.99、1.26。

1.6 蟲體死亡率的測定

取預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的8個梯度（含對照組）的藥物溶液各1 mL，加入10 個蟲體，實(shí)驗(yàn)分2 h 和12 h 兩組，各設(shè)3 個平行，結(jié)果取其平均值。每隔2 h 觀察1次。

1.7 半數(shù)抑制濃度（IC50）的計(jì)算方法

采用幾率單位法，根據(jù)死亡百分?jǐn)?shù)-幾率單位換算表，將死亡百分?jǐn)?shù)換算成死亡幾率單位，在兩者間成直線關(guān)系時，以回歸法求出IC50值[9]。

1.8 聯(lián)合毒性的評價方法

經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到單一毒性和聯(lián)合毒性的IC50后，采用相加指數(shù)法（AI）來評價聯(lián)合毒性。具體方法見參考文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一金屬離子的急性毒性效應(yīng)

Cd2+、Pb2+、Hg2+對膨脹腎形蟲的單一急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，Cd2+、Pb2+和Hg2+對膨脹腎形蟲24 h的IC50分別為11.303、6.840、0.312 mg/L；48 h的IC50分別為 8.951、6.305、0.275 mg/L；72 h的IC50分別為8.714、6.241、0.266 mg/L；96 h的IC50分別為5.196、4.365、0.262 mg/L。

2.2 兩種重金屬離子的聯(lián)合毒性作用

兩種重金屬共存時，聯(lián)合作用類型見表2-表4。由表2可知，Cd2+-Pb2+在濃度比1∶1和毒性比1∶1時，其AI值均小于零，為拮抗作用，表明Cd2+-Pb2+共存時相互降低了毒性作用。

由表3可知，Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1時，其AI值均大于零，為協(xié)同作用。毒性比1∶1時， 24 h的AI值小于零，為拮抗作用，48～96 h的AI值均大于零，為協(xié)同作用。由此可見，毒性比1∶1時， Pb2+-Hg2+組合的聯(lián)合毒性作用是先減弱后增強(qiáng)。

由表4可知，Cd2+-Hg2+在濃度比1∶1時為協(xié)同作用，相互增強(qiáng)了毒性作用；毒性比1∶1時為拮抗作用，相互降低了毒性作用。

2.3 3種重金屬離子的聯(lián)合毒性作用

3種重金屬共存時，聯(lián)合作用類型見表5。Cd2+-Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1∶1時為協(xié)同作用，表明此時3種離子共存相互增強(qiáng)了毒性。毒性比1∶1∶1時，24和48 h的AI值小于零，為拮抗作用，72和96 h的AI值均大于零，為協(xié)同作用，表現(xiàn)出毒性作用先減弱后增強(qiáng)。

3 討論

3.1 單一金屬離子對膨脹腎形蟲的急性毒性效應(yīng)

在不同濃度的重金屬作用下，膨脹腎形蟲的生長受到明顯抑制。比較3種重金屬離子在相同暴露時間下的IC50值，可得出3種重金屬離子對膨脹腎形蟲的毒性從大到小依次為Hg2+、Pb2+、Cd2+。李娜等[11]以鹵蟲（Artemia salina）無節(jié)幼蟲為試驗(yàn)材料，張青田等[12]以俄羅斯鹵蟲（Artemia parthenogenetica），Rehman等[13]以Euplotes mutabilis為試驗(yàn)材料研究了Hg2+、Pb2+、Cd2+等毒性作用，其毒性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)镠g2+、Pb2+、Cd2+，陳娜等[14]以水螅（Hydra sp.）為試驗(yàn)材料研究重金屬離子的毒性作用，結(jié)果表明其毒性大小順序?yàn)镠g2+、Cd2+、Pb2+，而Al-Rasheid等[15]以Euplotes mutabilis為試驗(yàn)材料研究重金屬離子的毒性作用，結(jié)果表明其毒性大小順序?yàn)镻b2+、Cd2+、Hg2+，說明金屬離子對生物體的毒性大小因物種而異。但總體上Hg2+的毒性比其他離子要大。3種重金屬離子IC50值隨作用時間的延長而變小，具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，這表明隨著作用時間延長，膨脹腎形蟲對重金屬離子的耐受性降低，這可能與重金屬離子在生物體內(nèi)的積累有關(guān)。

3.2 金屬離子對膨脹腎形蟲的的聯(lián)合毒性效應(yīng)

污染物的聯(lián)合毒性作用是一個復(fù)雜的問題，對于聯(lián)合作用的機(jī)理尚不明了，特別是對3種以上金屬離子的聯(lián)合毒性研究并不多見。Cd是生物體非必需元素，它使某些活性傳遞機(jī)制受阻，酶失活以及內(nèi)分泌系統(tǒng)受影響，并引起DNA單鏈斷裂，損害DNA修復(fù)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9，16]。Pb對生物體也有較強(qiáng)的毒性，能降低SOD的活性，從而導(dǎo)致氧自由基蓄積，引起生物膜脂質(zhì)過氧化作用而造成機(jī)體損害[9，17]。低濃度的Pb2+對酶有激活作用，高濃度則有抑制作用，而且是慢性毒性作用[18]。Hg 對于生物體一般都是劇毒的，Hg 的毒性很可能起因于它對巰基具有極大的親和作用，從而導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)和酶的失活[16]。已有研究表明細(xì)菌Enterobacter aerogenes存在利用汞離子還原酶解毒的機(jī)制[19]，在纖毛蟲體內(nèi)也可能存在類似對Hg 進(jìn)行解毒的機(jī)制。該機(jī)制在低濃度Hg作用下即可啟動，只有當(dāng)外界Hg 濃度超過其解毒能力時方產(chǎn)生毒害作用。

試驗(yàn)結(jié)果表明濃度比1∶1時，Cd2+或Pb2+對Hg2+的毒性具有協(xié)同作用，可能是低濃度的Cd2+或Pb2+與Hg2+共存于生物體時，使其細(xì)胞膜的通透性加大，從而毒性增強(qiáng)。毒性比1∶1時，Cd2+對Pb2+或Hg2+的毒性具有拮抗作用，這可能是由于Cd2+與Pb2+或Hg2+對進(jìn)入細(xì)胞的生物活性位點(diǎn)競爭的結(jié)果。由于金屬進(jìn)入細(xì)胞的活性位點(diǎn)有限，當(dāng)Cd2+濃度遠(yuǎn)大于Pb2+或Hg2+濃度時，這些進(jìn)入細(xì)胞的活性位點(diǎn)大部分被Cd2+所占據(jù)，使毒性較大的Pb2+或Hg2+無法進(jìn)入細(xì)胞。濃度比1∶1時Cd2+或Pb2+對Hg2+的毒性作用與毒性比1∶1時的作用結(jié)果不同，說明聯(lián)合作用效應(yīng)還與混合物的濃度及各組分的配比有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳娜等[14]、隋國斌等[20]、王銀秋等[21]、高曉莉等[22]的研究結(jié)果有一定的差異，可能的原因是聯(lián)合作用效應(yīng)不僅與污染物組成有關(guān)，也與測試生物的種類有關(guān)。

毒性比1∶1時，Pb2+-Hg2+組合24 h為拮抗作用，48～96 h轉(zhuǎn)為協(xié)同作用；Cd2+-Pb2+-Hg2+組合24～48 h為拮抗作用，72～96 h為協(xié)同作用，表明污染物對膨脹腎形蟲的聯(lián)合毒性隨暴露時間的不同而不同。修瑞琴等[23]在研究氟和硒對斑馬魚的聯(lián)合毒性，陳碧娟等[24]在研究乙醛和乙二醇對草魚幼魚聯(lián)合毒性時也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。至于這種先拮抗、后協(xié)同方式的作用機(jī)理尚不明確，需做進(jìn)一步的研究。

不同的生物種類對同一復(fù)合污染條件下的各個污染物以及污染物之間的交互作用有不同的反應(yīng)模式[25]。因此，當(dāng)幾種金屬離子共存于環(huán)境中時會產(chǎn)生復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)，僅用單一毒物的含量去判斷污染的毒性危害是不切實(shí)際的，生態(tài)環(huán)境的污染評價在測定單一毒物含量的同時，還應(yīng)從聯(lián)合毒性的角度對土壤污染做出綜合評價。

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