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摘要：采用超高效液相色譜法對(duì)陜西漢中柑橘（Citrus reticulata）的皮、肉、橘絡(luò)、橘子4個(gè)組織中的橙皮苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，柑橘中的橙皮苷與其他成分均能達(dá)到有效分離，橘皮、橘肉、橘絡(luò)、橘子中橙皮苷含量分別為332.21、50.85、581.34和641.73 mg/kg。該方法能夠用于柑橘及相關(guān)產(chǎn)品中橙皮苷的分析檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：柑橘（Citrus reticulata）組織；橙皮苷；測(cè)定；超高效液相色譜

中圖分類號(hào)：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1659-04

柑橘（Citrus reticulata）是蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Subfam. Aurantioideae Engl.）柑橘屬（Citrus L.）的一類水果，以檸檬、柚、葡萄柚、甜橙、寬皮橘為主要栽培品種[1]，柑橘果樹主要分布于熱帶、亞熱帶等135個(gè)國家和地區(qū)，是世界上種植面積和產(chǎn)量均最大的水果。國際柑橘年貿(mào)易額為80億美元，全世界柑橘常年總產(chǎn)量6 000萬～10 000萬t，僅次于小麥和玉米，是第三大國際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[2-4]。

中國是世界上柑橘栽培最早的國家，已有3 000多年的栽培歷史，戰(zhàn)國時(shí)期屈原所作《橘頌》中有“后皇嘉樹，橘徠服兮。受命不遷，生南國兮”的詩句，表明中國南方在2 000多年前開始廣泛栽培柑橘?，F(xiàn)今我國柑橘常年種植面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。柑橘在我國主要分布在北緯16°-37°，包括浙江、福建、湖南、四川、廣西、湖北、廣東、江西等19個(gè)省市、自治區(qū)都有柑橘栽培，但柑橘的經(jīng)濟(jì)栽培區(qū)主要集中在北緯20°-33°，海拔700～1 000 m以下的亞熱帶、熱帶地區(qū)，其中長江中上游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙南-閩西-粵東柑橘帶為我國柑橘優(yōu)勢(shì)栽培區(qū)。

柑橘的營養(yǎng)成分十分豐富，作為一種經(jīng)濟(jì)作物，全果均可利用。柑橘主要的功能成分有礦物質(zhì)、維生素、纖維素、胡蘿卜素和黃酮類物質(zhì)等。目前已從柑橘中鑒定出來的黃酮類化合物有60余種，最常見的為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、蕓香苷等二氫黃酮類化合物[5]。其中對(duì)柚皮苷的關(guān)注及研究較多[6-11]，而對(duì)橙皮苷的研究報(bào)道較少。

橙皮苷（Hesperidin）又名橘皮苷、橘皮甙，是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物，廣泛存在于豆科、唇花科、碟形花科、蕓香科柑橘屬植物中，具有維持血管正常滲透壓、降低血管脆性、增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性、縮短出血時(shí)間等作用。橙皮苷不僅具有降低人體內(nèi)膽固醇作用，還有抗病毒、提高免疫力的功效，具有消炎、抗氧化、抗菌、抗癌、防輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理活性[12-14]。

目前橙皮苷分析研究的方法有光譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[15]。超高效液相色譜（UPLC）作為一種高效分析技術(shù)，在柑橘有效成分分析方面報(bào)道較少，本研究采用超高效液相色譜對(duì)陜西漢中所產(chǎn)柑橘不同組織中的橙皮苷進(jìn)行分析，通過對(duì)柑橘不同組織中橙皮苷的分析，為柑橘類產(chǎn)品加工原料的選擇及地方柑橘資源的開發(fā)利用、柑橘品種選育及遺傳親緣關(guān)系研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 陜西漢中種植的主要柑橘品種宮川，取橘皮、橘肉、橘絡(luò)、橘子經(jīng)烘箱50 ℃烘干、粉粹，過60目篩備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 Waters ACQUITY-UPLC（Waters公司）配PDA檢測(cè)器；SHIMADZU AUY220電子天平（日本島津公司）；KQ100-DA超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；101-3A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（滬南電爐烘箱廠）；ZN-02中草藥粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）。

橙皮苷（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度為99.8%）；甲醇（分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，Burdick & Jackson公司）；純水（杭州娃哈哈飲料有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用甲醇溶解并定容于10.0 mL的容量瓶中，得到100.0 μg/mL的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)母液，備用。

1.2.2 檢測(cè)波長的選擇 吸取0.50 mL 100.0 μg/mL橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇溶解并定容于10.0 mL，進(jìn)行光譜掃描，選擇合適的檢測(cè)波長。

1.2.3 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC&BEH C18色譜柱（50.0 mm ×2.5 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為純水；采用梯度洗脫，A梯度：10%（0 min）-10%（1 min）-40%（5 min）-10%（6 min）；檢測(cè)波長283 nm；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；PDA檢測(cè)器；柱溫30 ℃。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 分別吸取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)母液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用甲醇定容于10.0 mL容量瓶，得到濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按上述色譜條件依次進(jìn)樣。測(cè)定各溶液的色譜峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5 樣品溶液的制備 精確稱取橘皮、橘肉、橘絡(luò)、橘子各0.50 g，加入15.0 mL甲醇于50.0 mL具塞三角瓶中超聲提取40.0 min，過濾，殘?jiān)俪曁崛?次，每次用10.0 mL甲醇，各提取10.0 min，合并提取液，用甲醇定容至50.0 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 按上述方法制備橘皮樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5.0 μL。測(cè)定橙皮苷的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）以考察方法的精密度。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取橘皮樣品，按上述方法制備供試溶液，平行測(cè)定5次，每次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定橙皮苷的峰面積，計(jì)算RSD以考察方法的重復(fù)性。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取橘皮樣品，按上述方法制備供試溶液，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進(jìn)樣，檢測(cè)橙皮苷的峰面積，以考察分析方法的穩(wěn)定性。

1.2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)，稱取已測(cè)定橙皮苷含量分別為332.2、50.8、581.3、641.7 mg/kg的橘皮、橘肉、橘絡(luò)、橘子試樣各0.50 g，分別加入1.0 mL橙皮苷含量為100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，按上述方法平行制備樣品3份，分別測(cè)定其含量，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的確定

對(duì)橙皮苷進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖1所示，橙皮苷最大紫外吸收波長為283.6 nm，查閱參考文獻(xiàn)[16-18]，本試驗(yàn)采用283 nm作為檢測(cè)波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。以橙皮苷的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=31 620.25x-21 235.4，R2=0.999 3，表明橙皮苷在2.0～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

按“1.2.6”方法，測(cè)得橙皮苷的峰面積分別為580.1、575.2、585.1、590.9、586.6，計(jì)算其RSD為1.04%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按“1.2.7”方法，測(cè)得橙皮苷的峰面積分別為580.8、570.4、584.8、605.3、560.2，計(jì)算其RSD為2.81%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

按“1.2.8”方法，測(cè)得0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h橙皮苷的峰面積分別為575.1、590.8、588.3、565.1、577.6，計(jì)算其RSD為1.80%，結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品溶液的分析結(jié)果

分別取5.0 μL按“1.2.5”方法制備樣品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)，色譜圖見圖3，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖2）比較，保留時(shí)間一致。

2.7 回收率測(cè)定結(jié)果

按“1.2.9”回收率試驗(yàn)方法測(cè)定并計(jì)算橙皮苷的加樣回收率，結(jié)果見表1，橙皮苷平均回收率為95%～102%，RSD小于5.0%，表明該分析方法的準(zhǔn)確度滿足分析要求，結(jié)果可信。

2.8 柑橘中橙皮苷的含量測(cè)定

按照樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，測(cè)定橘皮、橘肉、橘絡(luò)、橘子中的橙皮苷的含量，結(jié)果見表2，柑橘不同組織中橙皮苷含量差異顯著，橘子、橘絡(luò)中橙皮苷含量高，橘肉中橙皮苷含量低，橘皮中橙皮苷含量較高，可作為提取橙皮苷的原料。

3 小結(jié)與討論

3.1 橙皮苷的定性分析

在試驗(yàn)中同時(shí)分別采用了柚皮苷、新橙皮苷作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)柑橘提取物進(jìn)行比對(duì)定性，從圖4混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的出峰時(shí)間分別為3.50、3.59、3.71 min。而所有柑橘組織的制備樣品（圖3）出峰時(shí)間為3.37 min和3.59 min，3.59 min峰為橙皮苷峰，3.37 min峰暫時(shí)不能確定其成分，柚皮苷和新橙皮苷在該試驗(yàn)中未檢出。

與相關(guān)研究工作[19-21]比較發(fā)現(xiàn)，在色譜分析過程中均有柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜峰保留時(shí)間存在差異，其將樣品中的物質(zhì)定性為柚皮苷值得商榷，實(shí)際情況尚需進(jìn)一步確定。

3.2 UPLC分析條件的選擇

在該分析條件下，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷能完全分離，分離度大于1.5，分離效果好；色譜峰型好；運(yùn)用UPLC對(duì)柑橘提取物進(jìn)行分析，流速為0.3 mL/min，試劑消耗量小；流動(dòng)相采用乙腈和水就能達(dá)到較好的分離效果，避免使用緩沖溶液，有效提高儀器的使用壽命；6.0 min就能完成一次全分析，較HPLC分析縮短一半的分析時(shí)間，分析效率高。UPLC的高分析效率、高分離度、低溶劑消耗在色譜分析中優(yōu)勢(shì)顯著。

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