翟東霞　張亞妮　凌昌全

【摘要】 目的 觀察蜂毒素處理人Bel-7402細胞株后對其惡性表達行為的影響。方法 濃度為2μg/ml和4μg/ml兩個實驗組，以全反式維甲酸作為陽性對照，從細胞增殖的抑制、ConA凝集及克隆形成能力、甲胎蛋白含量、c-myc基因表達等方面進行觀察。結果 2μg/ml和4μg/ml蜂毒素均能抑制Bel-7402細胞株的增殖；蜂毒素處理后的細胞凝集及克隆集落形成能力降低；甲胎蛋白含量下降； c-myc基因表達顯著降低。結論 低劑量蜂毒素能有效誘導人Bel-7402細胞株惡性細胞生物學行為的轉化。

【關鍵詞】 蜂毒素；人Bel-7402細胞株；惡性表型；逆轉；誘導

【中圖分類號】R2-031 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-4949（2013）06-39-03

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一，普遍觀點認為，腫瘤細胞是從正常細胞轉化成的不受控制地無限增殖的細胞[1]。正常細胞的分化是有序、有限和有選擇的基因表達，而腫瘤細胞出現分化缺失、阻斷和異常，可以說，腫瘤就是一種細胞增殖和分化異常的疾病[2]。通過物理、化學或分子生物學的方法，“誘導分化”和/或“誘導逆轉”逐漸成為腫瘤研究領域的熱點。蜂毒素（Melittin）是蜜蜂毒的主要成分，為26個氨基酸組成的堿性多肽，生物活性高，對多種腫瘤細胞有殺傷作用[3-4]。本研究擬觀察低劑量蜂毒素處理人肝癌細胞后對細胞惡性表型的影響，初步探討其抑制腫瘤細胞作用可能的發(fā)生環(huán)節(jié)。

1 材料

1.1 試劑與藥品： 蜂毒素為本科實驗室采用凝膠色譜法純化制備（純度97%）；全反式維甲酸（ATRA）、四甲基偶氮唑藍（MTT）為美國Sigma公司產品； RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品；刀豆蛋白（ConA）為上海華舜生物公司提供；甲胎蛋白單克隆抗體酶免檢測試劑盒為瑞典CanAg公司產品；C-myc基因一抗為Santa Cruz公司產品。

1.2 細胞株： 人肝癌Bel-7402細胞株引自中國科學院上海細胞研究所，由長海醫(yī)院中醫(yī)科保存，常規(guī)接種于含100ml/L小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃，50 ml/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取生長期細胞進行實驗。

2 方法

2.1 細胞增殖抑制及生長曲線： 將人Bel-7402細胞以1×105/ml接種于24孔板中，24 h細胞貼壁后，分別加入濃度為2μg/ml和4μg/ml的蜂毒素，陽性對照為10μmol/l的全反式維甲酸，陰性對照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基，每個組別24孔×2板，于處理后取7個時間作用點（12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h）及1天-8天時，每個濃度各取3孔，用血細胞計數板，光鏡下計數活細胞數，計算抑制率。

2.2 刀豆蛋白（ConA）凝集試驗： 取相應處理組細胞，稀釋至濃度為1×105/ml，取無菌96孔板，按相應組別，分別向各孔中加入單細胞懸液100μl；再加入不同濃度（100、50、20、10、5μg/ml）的刀豆蛋白A（ConA）溶液；置37℃環(huán)境中，振蕩器上振蕩15min，倒置顯微鏡下觀察凝集情況。

2.3 平皿克隆形成試驗： 取生長良好的Bel-7402細胞，稀釋成200個/ml.接種在24孔無菌培養(yǎng)板中，每孔0.9ml，每組設3個平行對照，待細胞貼壁后，加入相應藥物，陰性對照加等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)10天后作克隆計數，每50個細胞為一個克隆并照相?？寺⌒纬梢种坡?（對照組克隆數-實驗組克隆數/對照組克隆數）×100%。

2.4 甲胎蛋白含量測定： 取生長狀態(tài)良好的Bel-7402，稀釋后加于無菌200ml培養(yǎng)瓶中， 24 h細胞貼壁后，給予相應藥物及對照處理，于第1、3、5、7日收集培養(yǎng)液，真空冷凍干燥，檢測時溶于等體積PBS中。按照甲胎蛋白（AFP）檢測試劑盒的操作要求，以酶聯免疫檢測儀，檢測波長在450nm顏色吸光度，產生的顏色深度與標本中AFP的量呈正比。

2.5 c-myc基因表達： 無菌6孔板內置載玻片，貼壁后給予相應藥物處理，每組取3片，培養(yǎng)5天后，95%乙醇固定。在固定好的細胞爬片上依次加入1：100稀釋的鼠抗人c-myc單克隆抗，生物素標記的二抗，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵蛋白共同孵育，DAB顯色劑室溫顯色，乙醇脫水后封片，200倍光學顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計學處理： 數據用x±s表示，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，經過方差齊性檢驗后，方差齊性采用單因素方差分析 （One-way ANOVA）、多重比較采用 LSD法，計數資料進行描述性分析。P<0.05表示差異有顯著意義，P<0.01表示差異有非常顯著意義。

3 結果

3.1 細胞增殖及生長曲線： 在12h，24h蜂毒素對細胞株的增殖已有不同程度的抑制，ATRA對細胞幾乎無作用；48h時，ATRA的抑制作用開始出現，隨著作用時間的延長，Mel組與ATRA組對細胞的抑制均隨之增強；120h時，ATRA較前一時間點抑制率降低，Mel組仍保持增強（P<0.05）；144h，各組抑制率均較120h時低。同時，如圖1所示：陰性對照組細胞呈快速上升趨勢，至第5d左右趨于平穩(wěn)；經過不同濃度蜂毒素及ATRA處理后，細胞生長曲線上升速率變慢。ATRA處理組的生長曲線斜率介于Mel-2組和Mel-4組之間。第7天起，各組細胞總數均有所回落。

3.2 刀豆蛋白（ConA）凝集試驗：如表1所示，處理后的Bel-7402細胞在同等濃度的ConA環(huán)境中，凝集陽性率明顯降低。在Mel-4組中幾乎喪失了凝集能力。

3.3 平皿克隆形成試驗： 陰性對照組克隆形成率在95%以上，處理各組克隆數較陰性組明顯降低（p<0.01），且單一克隆細胞數明顯少；蜂毒素兩個濃度之間也有差異，濃度高的4μg/ml蜂毒素組克隆形成數更少。

3.4 甲胎蛋白含量測定： 各組AFP分泌量均呈波浪形變化，培養(yǎng)第1天處于較低水平，各組間差別不大（p>0.05），提示Bel-7402細胞在貼壁過程中較少分泌AFP；培養(yǎng)及藥物處理第3天，AFP含量達高峰，第5天跌落。與陰性對照相比，相同處理天數，藥物作用后AFP分泌量顯著減少（p<0.05）；各個藥物處理組之間，以Mel-4組含量最低，ATRA組次之；ATRA組與Mel-2之間沒有顯著差異（p>0.05）。（表2）

3.5 c-myc基因表達： 陰性對照組中c-myc基因在Bel-7402細胞株中呈強陽性表達，主要分布于細胞核及核周邊的細胞質區(qū)域，染成棕褐色，呈斑片或顆粒狀。經蜂毒素處理后，細胞內c-myc基因表達減弱，陽性細胞數減少。在Mel-4組，見到的陽性細胞很少，呈淡黃色細小顆粒，分布于胞質緊靠核的區(qū)域，在細胞核內幾乎不表達。在ATRA組，c-myc基因表達也減弱，呈淺棕黃色顆粒，在核內表達較陰性對照明顯下降，但稍多于Mel-4組。

4 討論

細胞分化的發(fā)生是由于遺傳物質選擇性的表達差異導致了來源相同的細胞形態(tài)、功能出現了差別，誘導分化是腫瘤綜合治療的新手段，是指在某些因素的作用下，細胞的惡性行為降低，形態(tài)學趨向成熟，主要從增殖能力、細胞形態(tài)、功能變化、粘附聚集及相關基因表達方面進行研究。以往我們的實驗結果表明，蜂毒素在小劑量時對腫瘤細胞的殺傷作用減弱，抑制增殖及誘導凋亡的作用增強[5]。本實驗中，以2μg/ml和4μg/ml濃度的蜂毒素處理人Bel-7402細胞后，細胞總數減少但活細胞率保持在較高水平，細胞生長曲線上升速率變慢，進一步證實低劑量蜂毒素對細胞增殖的影響不是通過細胞毒效應介導的。同時，實驗結果也與肝癌細胞惡性程度密切相關的細胞凝集反應、克隆形成能力及分泌甲胎蛋白含量，經蜂毒素處理后，均出現明顯降低，與空白對照組存在顯著差異，部分結果優(yōu)于陽性對照ATRA。

c-myc蛋白是一種核內蛋白，是c-myc基因的表達產物，具有轉錄調控作用，幾乎所有增殖旺盛的細胞均有表達，其正常功能是使細胞產生增殖的未分化狀態(tài)，其異常的高表達可能使細胞產生分化不良，這是許多惡性腫瘤細胞的共性。本實驗中，經蜂毒素處理后的人Bel-7402細胞c-myc基因表達明顯降低，細胞核內表達幾乎缺失，故推測影響c-myc的表達可能是蜂毒素誘導人Bel-7402細胞分化轉變的作用環(huán)節(jié)之一，確切的作用機制值得進一步探討。當然，誘導細胞分化或逆轉是一個復雜的過程，可能是多通道、多靶點的綜合事件[7]，蜂毒素對此過程的影響仍需深入研究，值得我們做更多的工作，為在天然小分子物質中尋找有效的誘導分化物提供新依據和思路。

參考文獻

[1]鄭杰編著.腫瘤的細胞和分子生物學[M].上?？茖W技術出版社，2011.

[2]詹啟敏編著.分子腫瘤學[M].人民衛(wèi)生出版社，2005.

[3]陳永強，朱振安，郝永強，戴尅戎，，張晨.蜂毒素誘導骨肉瘤細胞U2OS凋亡與壞死的實驗研究.中西醫(yī)結合學報，2004.

[4]張晨，李柏，黃雪強，張亞妮，蘇永華，凌昌全.蜂毒素對肝癌細胞BEL-7402的增殖抑制作用.浙江中醫(yī)藥大學學報.2007，3l（5）：560-564.

[5]張晨，李柏，呂書勤，李勇，蘇永華，凌昌全.蜂毒素對人肝癌細胞線粒體膜蛋白7A6和凋亡相關基因產物Fas及其配體FasL表達的影響.中西醫(yī)結合學報，2007，5（5）：559-563.

[6]Bosch A，Bertran SP，Lu Y，Garcia A，Jones AM，Dawson MI， Farias EF.Reversal by RARα agonist Am580 of c-Myc-induced imbalance in RARα/RARγ expression during MMTV-Myc tumorigenesis.[J].Breast Cancer Res.2012.

[7]Jo M，Park MH， Kollipara PS，An BJ，Song HS. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 pathway.[J].Toxicol Appl Pharmacol.2012.