翁科娜　趙蕾　陳波

摘要] 目的 探討雌激素藥物（丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮）對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）OPN、MMP-9表達的影響。 方法 將建模成功的36例實驗用大鼠隨機性地均分為四組，各9例，分別給予丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮三種雌激素類藥物干預(yù)，另外使用酵母片進行干預(yù)，1個月后將大鼠殺死，將其在位與異位內(nèi)膜取出，運用RT-PCR法對OPN與MMP-9蛋白及基因表達進行分析、測定。 結(jié)果 三組雌激素藥物干預(yù)組干預(yù)后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中的OPN與MMP-9的表達均要明顯低于干預(yù)前，且干預(yù)前后差異存在高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；對照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中的OPN與MMP-9的表達要強于在位內(nèi)膜；三組雌激素干預(yù)組干預(yù)后在位與異位內(nèi)膜OPN表達無差異統(tǒng)計學意義（P > 0.05），但干預(yù)后雌激素干預(yù)組異位內(nèi)膜中MMP-9表達明顯強于在位內(nèi)膜（P < 0.01）；對照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中OPN mRNA的表達較干預(yù)前出現(xiàn)顯著性降低（P < 0.01），且在位與異位內(nèi)膜的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 雌激素類藥物能夠降低大鼠在位及異位內(nèi)膜中OPN與MMP-9的表達能力，且對異位內(nèi)膜中的OPN表達能力的抑制作用要明顯強于在位內(nèi)膜，對在位內(nèi)膜中的MMP-9表達能力的抑制性作用不亞于對異位內(nèi)膜；雌激素類藥物可能通過對局部病灶OPN及MMP-9表達能力的抑制作用進行抑制來減小細胞的侵襲及黏附性能。

[關(guān)鍵詞] EMS模型鼠；丙氨瑞林；米非司酮；孕三烯酮；子宮內(nèi)膜異位癥；OPN；MMP-9

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）06-0004-06

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）雖然為一種良性的婦產(chǎn)科疾病，但具有非常明顯的異地黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等類似于惡性腫瘤的生物學行為[1]。骨橋蛋白（osteopontin， OPN）屬于一種細胞信息傳導(dǎo)通路中的重要的磷酸化基質(zhì)蛋白，能夠促進細胞黏附、侵襲以及抗凋亡能力等方面的生成[2]。MMP-9與MMP-2能夠一同促進血管內(nèi)皮細胞的出芽，從而促使新生血管的形成，在子宮內(nèi)膜細胞的異位黏附、種植以及生長的過程中扮演著極為重要的角色[3，4]。本研究采用實驗的形式，根據(jù)移植法的相關(guān)要求及內(nèi)容，構(gòu)建EMS動物模型，對OPN、MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位及異位病灶中蛋白與基因表達方面的差異性進行檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康性成熟未交配的36只SD雌性大鼠，體重為205～243 g，平均體重（225.2±33.1） g，由我院實驗動物中心提供，對其進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗器材與試劑

1.2.1 實驗儀器 RT-PCR所需要的引物以及相應(yīng)的試劑均購自于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.2 試劑 一抗OPN（SC-21742）以及PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒均購自于北京中杉金橋有限公司，MMP-9購自于北京博奧深有限公司；丙氨瑞林（上海麗珠制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20050306）；米非司酮（浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20064188）；孕三烯酮（秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H19980003）。

1.3 實驗分組

取建模成功的36只大鼠隨機性地均分為以下四組，每組9只：①對照組：酵母片半片/d，連續(xù)用藥1個月；②丙氨瑞林組（GnRH組）：GnRH 7.5 μg/250 g皮下注射每天1次，連續(xù)使用1個月；③米非司酮組：0.62 mg/250 g每日1次，連續(xù)使用1個月；④孕三烯酮組：0.062 mg/次，每周使用兩次，連續(xù)使用1個月。兩組大鼠均取在位內(nèi)膜以及異位內(nèi)膜組織。所取組織可以分為如下兩個部分：一部分取材之后立即于-80℃溫度條件下進行冷凍保存（PCR實驗用），另外一部分做成石蠟標本（免疫組化用）[5-7]。

1.4 免疫組化SP法檢測OPN、MMP-9的表達

免疫組化步驟應(yīng)嚴格參照說明書上的操作說明來進行，切片經(jīng)過DAB顯色之后在高倍鏡下進行組織學觀察。上述四組干預(yù)前后在位以及異位內(nèi)膜組織的切片均隨機取5個重疊度低的高倍鏡視野（實驗中選擇400倍最佳），應(yīng)用Image Proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算每高倍鏡視野之下的OPN以及MMP-9的積分吸光度值（IOD）的均值[8，9]。

1.5 統(tǒng)計學處理

本研究中的數(shù)據(jù)均由SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計及分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P < 0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SP法條件下四組內(nèi)膜中OPN的表達

SP法條件下，對照組干預(yù)前后OPN的表達變化差異無統(tǒng)計學意義；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后OPN的表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 SP法條件下四組內(nèi)膜中MMP-9的表達

對照組干預(yù)前后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜MMP-9的表達比較無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后MMP-9的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 RT-PCR檢測兩組組織中的OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達

RT-PCR檢測時對照組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜干預(yù)前后OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表3、表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展與多種綜合性因素有著一定的關(guān)系，其中MMP-9、OPN就是其中兩大影響因子，越來越多地被臨床實踐研究證實，此兩種影響因子與EMS的進展密切相關(guān)[10]。MMP-9屬于一種明膠酶，它能夠?qū)毻饣|(zhì)以及基底膜的成分加以降解，通過多種綜合性的途徑來促進EMS的發(fā)生與發(fā)展。OPN屬于一種磷?；?、具有親水性的酸性分泌型糖蛋白，它含有絲氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸基團類物質(zhì)，能夠有效地促進腫瘤細胞的趨化、黏附以及遷移等過程[11，12]。

國內(nèi)外研究表明，OPN能夠促使內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細胞數(shù)量增多、侵襲以及轉(zhuǎn)移，從而促進內(nèi)膜異位癥的發(fā)展。相關(guān)學者在對人類內(nèi)膜異位癥的研究過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物治療后內(nèi)膜異位癥患者組織中的MMP-9以及OPN的表達能力急劇降低，并認為MMP-9、OPN能夠作為反映EMS發(fā)生與發(fā)展的指示性物質(zhì)。許多雌激素類藥物會對OPN、MMP-9的表達起到一定的抑制作用。本文主要對三類雌激素類藥物，即丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮對大鼠OPN、MMP-9的表達的作用進行研究。本研究表明，三組雌激素藥物干預(yù)后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中的OPN、MMP-9的表達均明顯低于干預(yù)前，且干預(yù)前后差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；對照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中的OPN、MMP-9的表達強于在位內(nèi)膜；三組雌激素干預(yù)后在位與異位內(nèi)膜OPN表達不存在統(tǒng)計學意義（P > 0.05），但是干預(yù)后雌激素干預(yù)組異位內(nèi)膜中MMP-9表達明顯強于在位內(nèi)膜（P < 0.01）；對照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中OPN mRNA的表達較干預(yù)前出現(xiàn)顯著性降低（P < 0.01），且在位與異位內(nèi)膜的表達不存在統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

綜上所述，雌激素類藥物能夠降低大鼠在位及異位內(nèi)膜中OPN與MMP-9的表達能力，且對異位內(nèi)膜中的OPN表達能力的抑制作用明顯強于在位內(nèi)膜，對在位內(nèi)膜中的MMP-9表達能力的抑制性作用不亞于對異位內(nèi)膜；雌激素類藥物可能通過對局部病灶OPN及MMP-9表達能力的抑制作用進行抑制來減小細胞的侵襲及黏附性能。

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（收稿日期：2012-12-13）