楊 晴，李新宇，馬傳根，郭素蓮，信文啟，張 摯，李 淵

(1河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南開封475000;2蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院)

心肺復(fù)蘇(CPR)的本質(zhì)是全身組織器官的缺血再灌注損傷(I/R)［1］。I/R是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷。能量代謝障礙在腦I/R的損傷機(jī)制中作為始動因素存在，是心臟驟停(CA)后腦組織損傷的主要病理生理改變，是引發(fā)腦缺血后損傷機(jī)制的關(guān)鍵步驟。若能預(yù)防或減輕因I/R引起的三磷酸腺苷(ATP)含量的降低，則有可能防止腦損傷級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。烏司他丁(UTI)是一種廣譜的水解酶抑制劑，對CPR后腦I/R具有良好的保護(hù)作用［2］。UTI能否在缺血早期緩解ATP耗竭這一最早發(fā)生的代謝紊亂，并能在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后盡早恢復(fù)ATP水平尚無定論。2011年3月～2012年3月，我們采用窒息型大鼠CA與CPR模型，研究UTI對大鼠復(fù)蘇早期(1 h)腦組織能量代謝的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 清潔級成年健康雄性SD大鼠60 只，體質(zhì)量350 ～450 g，平均(385．8±13．4)g。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(C組)、生理鹽水組(N組)、UTI組(U組)，每組20只。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。

1．2 CPR模型建立 采用窒息法并加以改進(jìn)建立大鼠CPR模型［3］。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)和記錄均參照復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)研究的Utstein模式［4］。3%戊巴比妥鈉(35 mg/㎏)腹腔注射麻醉，將動物仰臥固定于手術(shù)臺上，從左股靜脈置入24號套管針保留靜脈通道，分離右側(cè)頸總動脈，遠(yuǎn)心端用0號絲線結(jié)扎，近心端插入注滿肝素的22號套管針連接壓力換能器，使用MP50多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀(德國飛利浦)監(jiān)測有創(chuàng)動脈血壓，插四肢皮下電極監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，氣管切開置管(用來接呼吸機(jī))。大鼠手術(shù)后室溫下穩(wěn)定10 min，N組和U組于呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管，窒息7～9 min，待大鼠心跳停止后3 min開始開放氣道，進(jìn)行CPR:HX-300S動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣(呼吸頻率80次/min，潮氣量8 mL/kg，100%氧氣)，同時(shí)行胸外心臟按壓，按壓頻率160次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，同時(shí)經(jīng)股靜脈推注腎上腺素20μg/kg，必要時(shí)追加同等劑量，直至ROSC。記錄窒息至CA時(shí)間(從開始夾閉氣管至CA的時(shí)間)和ROSC時(shí)間(從開始CPR到確認(rèn)自主循環(huán)已恢復(fù)的時(shí)間)，15 min無效者放棄復(fù)蘇，且CPR后處死時(shí)相之前發(fā)生死亡的，該動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無效，另外進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。C組僅行麻醉、氣管插管、左股靜脈和右頸動脈穿刺，不進(jìn)行夾管窒息及CPR。

各組均于ROSC后2 min內(nèi)經(jīng)股靜脈予以下處理:①N組給予2 mL生理鹽水;②U組給予UTI(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號:03090921)100 000 U/kg，與生理鹽水配伍成2 mL溶液。各組大鼠體質(zhì)量、麻醉藥用量、腎上腺素用量、窒息至心臟停搏時(shí)間、復(fù)蘇至ROSC時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．3 腦組織三磷酸腺苷(ATP)和乳酸(LA)含量測定 C組于氣管切開置管后1 h，N組和U組于ROSC后1 h快速斷頭處死，在冰袋上迅速取左側(cè)大腦組織，液氮冷凍，批量待測。采用分光光度計(jì)測定腦組織中ATP和LA［5］。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1．4 海馬組織病理觀察 大鼠處死后按照鼠腦解剖圖譜分離大鼠海馬組織，取1 mm×1 mm×1 mm大小左側(cè)海馬組織快速置于4%戊二醛液中固定，丙酮或乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，經(jīng)鋨酸染色制成超薄切片。H-600型透射電子顯微鏡下觀察海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組比較采用方差分析。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene＇s法，方差齊時(shí)多組間均數(shù)比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Tamhane＇s檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 腦組織ATP和LA 與C組比較，N組和U組大鼠腦組織ATP含量在ROSC后1 h均明顯下降(P均＜0．05)，而N組和U組大鼠腦組織LA含量在ROSC后1h均明顯升高(P＜0．01);與N組比較，U組大鼠腦組織ATP顯著升高(P＜0．05)，而U組大鼠腦組織LA顯著降低(P＜0．05)，詳見表1。做散點(diǎn)圖后發(fā)現(xiàn)ATP和LA之間有線性相關(guān)趨勢，進(jìn)一步做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ATP與LA呈負(fù)相關(guān)(r=－0．535，P ＜0．05)。

2．2海馬組織超微結(jié)構(gòu)C組可見海馬神經(jīng)細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清楚，線粒體呈橢圓形，大小正常，嵴規(guī)則，膜結(jié)構(gòu)完整;N組ROSC后1 h海馬神經(jīng)細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，線粒體腫脹，部分出現(xiàn)空泡，嵴排列不規(guī)則;而U組ROSC后1 h海馬神經(jīng)細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚清楚，病變明顯輕于N組，線粒體輕度腫脹，嵴排列略有不規(guī)則，膜結(jié)構(gòu)完整。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，CA后腦血流中斷4～5 min ATP就會耗竭［6］，ATP先于一些介質(zhì)最早發(fā)生功能障礙，使細(xì)胞膜上離子泵功能障礙，細(xì)胞不能維持正常膜內(nèi)外離子濃度梯度，出現(xiàn)K+外流、Na+內(nèi)流伴隨Ca2+和 Cl－分布異常，影響腦細(xì)胞功能［7］。ATP 是CA后各種代謝紊亂和引起腦組織損傷的中心環(huán)節(jié)。提高缺氧腦細(xì)胞中ATP水平可減輕炎性細(xì)胞因子損傷、興奮性氨基酸釋放、自由基生成、凋亡基因激活等一系列病理生理反應(yīng)，減輕腦組織損傷。

表1 各組腦組織ATP和LA水平比較(ˉx±s)

CA后血糖、血氧供應(yīng)中斷，線粒體有氧供給劇減，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無氧酵解增強(qiáng)，LA增多，CO2、H+等代謝產(chǎn)物堆積，造成細(xì)胞內(nèi)酸中毒和高滲透壓。LA水平升高一方面可抑制線粒體的功能，已有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PH值低于6時(shí)，線粒體呼吸功能受到不可逆損傷;另一方面可加重NAD/NADH破壞，使其儲備減少，自由基生成增加，并可加速脂質(zhì)過氧化過程，加重腦損傷。因而及時(shí)有效地清除腦LA有助于復(fù)蘇后腦細(xì)胞的成活。本研究結(jié)果顯示，與C組相比，N組ROSC后1 h腦組織ATP含量明顯降低、LA水平明顯升高，說明復(fù)蘇后大鼠腦組織處于氧合代謝不全狀態(tài)。腦組織ATP和LA存在負(fù)直線相關(guān)關(guān)系，提示CPR后腦組織ATP產(chǎn)生越少，能量代謝障礙越重，無氧酵解越強(qiáng)，LA產(chǎn)生增多導(dǎo)致LA堆積和酸中毒，二者相互影響，相互促進(jìn)，惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重腦損傷。

UTI是含有143個(gè)氨基酸的糖蛋白，半衰期為40 min，是一種蛋白酶抑制劑，能夠抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性［8］。本研究結(jié)果顯示，U組ROSC后1 h腦組織ATP水平較N組顯著升高，而LA水平較N組顯著降低。表明UTI可降低ROSC后大鼠腦組織LA水平，提高ATP水平。大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示UTI通過以下機(jī)制提高CA/CPR后的ATP水平，減少LA產(chǎn)生，減輕腦組織損傷:UTI可阻斷I/R時(shí)Ca2+超載所致的磷脂酶激活途徑，保護(hù)細(xì)胞膜和溶酶體膜，提高線粒體的呼吸功能，使ATP增加;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UTI腹腔注射入沙土鼠腦I/R模型后具有抗腦缺血引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和清除自由基效應(yīng)，可保護(hù)腦組織免受自由基損傷［9］;Masuda等［10］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用UTI可恢復(fù)再灌注后心肌能量代謝，能夠通過抑制心肌細(xì)胞線粒體氧化磷酸化能力的減弱，維持線粒體功能，較快恢復(fù)細(xì)胞能量供應(yīng);UTI的分子結(jié)構(gòu)中有與細(xì)胞膜受體結(jié)合的位點(diǎn)，并且第10位絲氨酸上有帶負(fù)電荷的糖鏈，可以起到穩(wěn)定溶酶體膜的生理功能，溶酶體功能與ATP代謝間存在較強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，因此UTI能提高復(fù)蘇后大鼠腦組織ATP水平;Wiedow等［11］研究表明嗜中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和控制炎癥進(jìn)程中起到重要作用，UTI作為絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制過度的炎癥反應(yīng)，Li等［12］研究結(jié)果也顯示UTI能抑制單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，抑制過度的炎癥反應(yīng)，從而有助于能量代謝的進(jìn)行。通過上述機(jī)制，UTI能夠切斷失控的炎癥反應(yīng)，減少氧自由基的生成，改善毛細(xì)血管通透性，從而改善腦微循環(huán)和腦組織灌注，緩解組織的缺氧，有效保護(hù)腦等器官的功能［13］。隨著缺血缺氧的改善，LA生成減少，而臟器功能改善也增強(qiáng)對LA的分解代謝能力，通過上述機(jī)制UTI能部分改善腦能量代謝，減輕腦組織LA酸中毒，在復(fù)蘇早期(1 h)即能顯示出療效。

線粒體是細(xì)胞產(chǎn)能和儲存能量的細(xì)胞器，I/R時(shí)自由基脂質(zhì)過氧化和Ca2+超載等原因?qū)е戮€粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能異常，大量的線粒體的破壞導(dǎo)致腦組織發(fā)生繼發(fā)性能量代謝障礙。從某種意義上說，線粒體是腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞退行性變的關(guān)鍵［14］。U組ROSC后1h海馬神經(jīng)細(xì)胞各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚清楚，病變明顯輕于N組，線粒體輕度腫脹，嵴排列略有不規(guī)則，膜結(jié)構(gòu)完整，表明UTI可以通過保護(hù)線粒體使CPR后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和呼吸功能都得到了一定的恢復(fù)。其保護(hù)線粒體的作用可能與UTI穩(wěn)定溶酶體膜、抑制炎癥介質(zhì)過度釋放及清除氧自由基等有關(guān)［15］。

本研究結(jié)果證實(shí)，UTI可改善CPR早期腦能量代謝，減輕腦損傷。但其最佳劑量及給藥時(shí)機(jī)有待進(jìn)一步研究。

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