史 磊，曹秉振

(遼寧醫(yī)學(xué)院濟南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，濟南250031)

腓骨肌萎縮癥即 Charcot-Marie-Tooth病(CMT)，是一組由不同致病基因引起的臨床表型基本相似的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，其主要特征為慢性進行性加重的肢體遠端無力、肌萎縮和感覺損害［1］。CMT的遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳(AD)，也可見常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性或隱性遺傳(XD或XR)。最常見的類型為CMT1型，其中50% ～70%的CMT1患者及90%的散發(fā)病例為CMT1A型［2］，多由17號染色體短臂11.2區(qū)(17p11.2)包含周圍髓鞘蛋白PMP22基因在內(nèi)的1.5 Mb的正向串聯(lián)重復(fù)突變所致。目前，有效檢測短片段重復(fù)突變的實驗方法主要有實時熒光定量PCR、等位基因特異性PCR-雙酶切、短串聯(lián)重復(fù)序列分析(STR)、多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)等。等位基因特異性PCR具有操作簡便，對操作條件要求較低等優(yōu)點，但其靈敏度與可靠性有待進一步驗證，且人為因素影響較大。MLPA技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項新的基因定量技術(shù)，可同時對多基因多外顯子進行重復(fù)、缺失及定量分析，且已開發(fā)出特異的CMT1型試劑盒，操作方便，靈敏度高。我們于2012年3～8月進行本研究，初步探討等位基因特異性PCR及MLPA兩種方法對PMP22基因重復(fù)突變檢測的一致性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 CMT患者6例，均來源于近2年來就診于濟南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的散發(fā)病例，所有病例診斷均符合Harding于1980年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。正常對照為健康成人6例，均無肢體無力、肌萎縮及遺傳病家族史。所有受試者征得本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理 抽取患者及健康對照外周靜脈血3～5 mL，用EDTA抗凝，Promega試劑盒提取全血標(biāo)本基因組DNA。

1.2.2 等位基因特異PCR引物設(shè)計與合成 在PMP22基因重復(fù)片段遠端和近端CMT1A-REP區(qū)域內(nèi)設(shè)計兩對引物，分別為 F1、R1、F2、R2，引物 F1與R1、F2與R2可擴增出患者與正常人均有的遠端和近端正常存在的2片段，而F1與R2可擴增出特異性重復(fù)連接片段［4］，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PMP22等位基因特異PCR引物序列表

1.2.3 PCR反應(yīng)及條件 反應(yīng)體系:總體積25 μL，其中 dNTP Mixture(2 mmol/L)2.5 μL，10 ×PCR buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.125 U，基因組DNA 1 μL，上下游引物(5 μmol/L)各 2.5 μL，三蒸水13.875 μL。反應(yīng)條件為在 GeneAmp PCR system 2400熱循環(huán)儀上94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，56 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 3 min，25 次循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存。反應(yīng)完成后取5 μL PCR 產(chǎn)物與1 μL 溴乙錠混合，0.8%瓊脂糖凝膠電泳(加核酸染色液)檢測產(chǎn)物。

1.2.4 MLPA檢測 MLPA檢測試劑盒 SALSA P033購自MRC-Holland，具體操作過程如下:①DNA定量及變性:取基因組DNA 1 μL，加TE稀釋至5 μL，在熱循環(huán)儀上98℃變性5 min后冷卻至25℃。SALSA MLPA 探針雜交:分別加入 1.5 μL P033 探針混合物及1.5 μL MLPA buffer，小心混勻后 95 ℃變性1 min，60℃下雜交16～20 h。②連接及擴增:雜交后在54℃下加入連接混合物(25 μL三蒸水、3 μL連接緩沖液 A、3 μL 連接緩沖液 B、1 μL 連接酶)孵育15 min，然后98℃加熱5 min以滅活連接酶，待溫度降至20℃后，加入PCR反應(yīng)混合物(7.5 μL 三蒸水、2 μL SALSA PCR 引物混合物、0.5 μL SALSA聚合酶)，PCR反應(yīng)條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次，72℃延伸20 min。③毛細管凝膠電泳檢測:取0.7 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入0.2 μL LIZ-500標(biāo)記物及9 μL甲酰胺(LIZ-500及甲酰胺均為美國ABI公司生產(chǎn))，80℃變性2 min后立即置冰架上冷卻，最后用毛細管凝膠電泳檢測(在ABI3130基因測序儀上進行)，程序結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，結(jié)果用Coffalyser軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 等位基因特異性PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果 6例患者及6例健康對照均出現(xiàn)F1與R1、F2與R2引物擴增出來的正常條帶，均未出現(xiàn)F1與R2擴增的特異性短片段重復(fù)的異常條帶。

2.2 MLPA檢測分析 根據(jù)Coffalyser軟件說明，將各目的片段的峰面積除以全部內(nèi)參照峰面積之和，所得該目的片段的峰面積比值，再將此峰面積比值除以相對應(yīng)的正常外對照峰面積，所得比值即為拷貝數(shù)比值，從而可計算出目的片段的拷貝數(shù)。正常人該比值波動在0.7 ～1.3，1.7 ～2.3 為重復(fù)性患者［5］。運行軟件分析得出:6例患者及6例健康對照的PMP22基因全部在0.7～1.3，表明所有被檢測患者及對照的PMP22基因均未出現(xiàn)重復(fù)突變。

3 討論

CMT是一組臨床較多見的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，最常見的是17號染色體短臂11.2區(qū)(17p11.2)正向串聯(lián)重復(fù)突變所導(dǎo)致的CMT1A型，此外還有40個其他不同的致病基因被定位［6］，這些基因可導(dǎo)致CMT2(軸突型)、CMT3、CMT4、CMTX、CMTDI等類型，所有類型的CMT患者的臨床表型基本相似。目前，該病的診斷主要依靠家族史、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)電生理及周圍神經(jīng)活檢，致病基因的檢測應(yīng)用較少，但其可以更進一步確診并明確該病的亞型，為臨床診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。根據(jù)國內(nèi)外文獻的報道，PMP22基因重復(fù)突變所致CMT的患病率最高，所以本研究我們主要檢測了臨床搜集的CMT患者PMP22基因是否存在短片段重復(fù)突變。

等位基因特異性PCR是直接對PMP22基因交換熱點區(qū)設(shè)計引物擴增出特異性連接片段，再經(jīng)限制性酶切來驗證產(chǎn)物。Kon-Ping Lin等根據(jù)已被共識的近端和遠端CMT1A-REP序列設(shè)計出了PMP22等位基因特異性引物，共有4種擴增方式，擴增產(chǎn)物可進一步被EcoRI和NsiI兩種酶驗證［7］，由于我們的樣本均未擴增出異常的片段條帶，故無需用兩種酶進行驗證。該方法的應(yīng)用現(xiàn)已比較成熟，其優(yōu)點是簡便易行，對操作條件及成本要求較低，但其靈敏度和準(zhǔn)確性仍需進一步驗證，因此可作為臨床上基因篩查的第一步。而新技術(shù)MLPA-CMT1A試劑盒的探針基本覆蓋了PMP22基因外顯子的所有熱點區(qū)域，且能同時檢測基因的重復(fù)與缺失，敏感度及準(zhǔn)確度較等位基因特異性PCR更高，且MLPA與熒光定量PCR、STR等方法相比也具有一定的優(yōu)勢:①可同時檢測多基因多外顯子的重復(fù)或缺失，②對DNA模板定量及純度要求較低。當(dāng)然，MLPA也有自身的缺點和限制，比如價格稍昂貴、對實驗室的配置條件要求較高等。因此，兩種方法對特異性短片段重復(fù)突變的檢測都具有不可替代的作用和意義。在臨床患者初篩或基礎(chǔ)設(shè)施比較簡單的實驗室條件下，可以先采用等位基因特異性PCR進行檢測，對可疑陽性患者再進一步選擇靈敏度和準(zhǔn)確度更高的ML-PA確定診斷。

本研究中對同一樣本同時應(yīng)用了這兩種方法，目的是檢測兩種方法對于PMP22基因突變檢查的一致性，指導(dǎo)臨床建立基因篩查的程序。研究結(jié)果顯示，在6例CMT患者和6例正常對照中，兩種檢查手段都得出了陰性結(jié)果，提示兩種方法在檢測結(jié)果上的一致性。但由于本研究樣本數(shù)量較小，且缺少真正的短片段重復(fù)突變陽性結(jié)果，使得結(jié)論的說服性比較局限，故仍需擴大樣本量以進一步證實。另外CMT涉及致病基因很多，其臨床表型和基因類型缺乏一致性，陰性結(jié)果并不排除患者存在其他的基因異常，因此仍需要進一步基因檢查以明確致病基因。

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