薛 婷，吳利先

(云南大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，云南大理671000)

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，但近年研究已證實其為院內(nèi)感染的重要致病菌［1］。20世紀(jì)80年代以來，腸球菌嚴(yán)重感染的發(fā)生率和病死率明顯升高，已成為傷口和尿路感染最常見的致病菌，導(dǎo)致菌血癥的第三大致病菌，其中糞腸球菌是與臨床感染相關(guān)的最常見腸球菌，還可引起腹腔感染、肺囊性纖維化、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等［2］，并且由于其固有耐藥和獲得性耐藥，使腸球菌感染的治療非常棘手［3］。腸球菌普遍具有形成生物被膜的能力，它可以阻礙或延遲細(xì)菌與抗生素接觸，則降低腸球菌對藥物的敏感性，致使感染難以治愈［4］。細(xì)菌生物被膜在細(xì)菌致病機(jī)制及耐藥性形成中均具有重要意義。因此，學(xué)者們開始關(guān)注腸球菌引起的感染，探討腸球菌生物被膜形成的分子機(jī)制。細(xì)菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］，糞腸球菌生物被膜形成也是如此。我們用PCR技術(shù)對分離的糞球菌生物被膜菌組和浮游菌組細(xì)菌中的ebpA、gelE和fsrB三種與生物被膜形成相關(guān)的基因進(jìn)行檢測，探討糞腸球菌生物被膜形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 無菌操作收集云南省大理學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科2011年10月～2012年5月留置導(dǎo)尿管患者導(dǎo)尿管標(biāo)本，按衛(wèi)生部頒布《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行培養(yǎng)和生化反應(yīng)。

1.2 主要試劑及儀器 BHI培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)有限公司提供;PCR試劑，溶菌酶，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及Ladder Marker均由北京天根生化科技有限公司提供。全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀VITEK2為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增儀為PE公司產(chǎn)品，全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)為Syngene公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 將收集至醫(yī)院的導(dǎo)尿管標(biāo)本，通過剛果紅培養(yǎng)基、生物被膜半定量檢測以及細(xì)菌生理生化反應(yīng)，可疑菌株用全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，篩選生物被膜陽性糞腸球菌及其相應(yīng)的浮游菌。

1.4 基因擴(kuò)增 將鑒定過的細(xì)菌培養(yǎng)過夜，用DNA提取試劑盒提取DNA作為模板，根據(jù)Gene Bank中的序列設(shè)計引物。gelE-F:5'-AGT GAA CGC TAC AGA TGG AAC-3'，gelE-R:5'-CGT TCC GTG TAA AGC AAT TCC-3'，長度 145 bp;ebpA-F:5'-AAA AAT GAT TCG GCT CCA GAA-3'，ebpA-R:5'-TGC CAG ATT CGC TCT CAA AG-3'，長度 111 bp;fsrB-F:5'-TGG ATC AGG AAG ATC AAT CAG G-3'，fsrB-R:5'-GTA CGA CGT ATA CAA TAA AGG TTT CG-3'，長度147 bp。取1 μL DNA 為 PCR 模板，濃度為25 μmol/L的上述引物各1 μL為進(jìn)行 PCR。反應(yīng)條件為:95℃3 min后，按下列參數(shù)循環(huán)35次，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，最后72℃延伸5 min。凝膠成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行 χ2統(tǒng)計分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 通過剛果紅培養(yǎng)基、生物被膜半定量檢測以及細(xì)菌生理生化鑒定得到糞腸球菌生物被膜菌21株及其相應(yīng)的浮游菌21株。

2.2 gelE、ebpA和fsrB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 對上述21株生物被膜糞腸球菌及其相應(yīng)的浮游菌行g(shù)elE、ebpA和fsrB基因的PCR擴(kuò)增后，陽性菌株出現(xiàn)了相應(yīng)的條帶，見圖1～3。

2.3 gelE、ebpA和fsrB基因的檢測結(jié)果分析 21株生物被膜糞腸球菌gelE、ebpA和fsrB基因的陽性率分別是 9.52%(2/21)、95.24%(20/21)和9.52%(2/21);其相應(yīng)的21株浮游菌組糞腸球菌檢測出的陽性率分別是85.71%(18/21)、9.52%(2/21)和90.48%(19/21)，兩者比較(χ2值分別為 24.436、9.348、27.524，P 均 ＜0.05)。

3 討論

圖3 fsrB基因PCR檢測電泳圖

腸球菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染常見的條件病原菌，當(dāng)人體免疫力低下或腸球菌定植部位改變時，可引起泌尿道感染、腹腔感染、傷口感染，甚至菌血癥及敗血癥、心內(nèi)膜炎等。因此，對腸球菌致病性的研究引起了人們的高度重視。

細(xì)菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］。gelE基因編碼的明膠酶，gelE的表達(dá)由 fsr編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，與糞腸球菌生物被膜的形成有關(guān)。fsr調(diào)節(jié)基因座由fsrA、fsrB和fsrC三個基因組成，編碼糞腸球菌fsr密度感應(yīng)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過影響明膠酶的生成影響生物膜的形成，fsr缺失突變株減少了聚苯乙烯平板上腸球菌生物膜形成［6，7］。菌毛形成是生物膜形成的必要條件，由多種類型的前體蛋白交聯(lián)構(gòu)成。ebp基因座編碼菌毛，ebp操縱子包含ebpA、ebpB、ebpC和相關(guān)的srtC(編碼分選酶C)基因［8］。糞腸球菌菌毛缺失突變株減少了糞腸球菌菌毛操縱子ebpA、B、C的表達(dá)，減少了菌毛的產(chǎn)生，導(dǎo)致原發(fā)粘附的缺失，不能形成生物膜［9］。本實驗采用PCR技術(shù)檢測所篩選的21株糞腸球菌生物被膜菌及其浮游狀態(tài)菌的gelE、ebpA和fsrB基因，發(fā)現(xiàn)ebpA代表的菌毛操縱子在生物被膜陽性組中表達(dá)率高于浮游菌組，而gelE與fsrB基因的結(jié)果相反，生物被膜組中表達(dá)率均要低于浮游菌組，這與文獻(xiàn)相一致［10］。

因此，可推測ebpA基因能促進(jìn)糞腸球菌生物被膜形成;gelE和fsrB基因可抑制生物被膜形成。這將為進(jìn)一步研究腸球菌生物被膜形成的分子機(jī)制，深入確定可行的藥物靶點和小分子物質(zhì)，以達(dá)到抑制生物被膜形成和抑制感染期病原體毒性，來解決實際臨床難題提供依據(jù)。

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