楊秀蓮，王 筑，佟麗波

(1惠州市第三人民醫(yī)院，廣東 惠州 516002;2佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

正常細(xì)胞的正常更新要依賴細(xì)胞增殖與調(diào)亡的平衡來調(diào)節(jié)。腫瘤組織的生長失控不僅與細(xì)胞增殖旺盛有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制使其生存期延長有關(guān)。WWOX是最新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，有研究表明它是一種促凋亡蛋白，參與細(xì)胞凋亡通路的調(diào)節(jié)。Bcl-xl是Bcl-2基因家族的成員之一，主要參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的負(fù)相調(diào)控，可阻止各種應(yīng)激所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡過程。許多研究表明，WWOX、Bcl-xl在許多惡性腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)WWOX與Bcl-xl蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集惠州市第三人民醫(yī)院及佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2008年9月～2012年6月存檔的石蠟包埋標(biāo)本60例，其中宮頸鱗癌50例、宮頸上皮內(nèi)瘤變10例、正常宮頸組織標(biāo)本10例?；颊吣挲g28～70(48±9.44)歲。Ⅰ期32例，Ⅱa期18例;病理分化程度:高分化20例，中低分化30例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。其病程經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究標(biāo)本均再次做HE染色，由兩位病理醫(yī)師再次證實(shí)。

1.2 主要試劑 兔抗人WWOX單克隆抗體、兔抗人Bcl-xl單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 常規(guī)切片，HE染色，采用中杉公司推薦的SP免疫組化染色法，檢測(cè)細(xì)胞中WWOX及Bcl-xl蛋白的表達(dá)情況。WWOX抗體用PBS 1∶100稀釋為工作液，Bcl-xl抗體用PBS 1∶150稀釋為工作液，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知卵巢癌陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 光鏡下觀察，WWOX和Bcl-xl抗原陽性反應(yīng)均為位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色均勻細(xì)顆粒。參照綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)(占總細(xì)胞數(shù)的百分比)進(jìn)行半定量處理。染色強(qiáng)度按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:細(xì)胞無顯色者為0分，呈淺黃色者為1分，呈棕黃色者為2分，呈棕褐色者為3分;陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分方法:陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)10% ～50%者為2分，51% ～80%者為3分，＞80%者為4分。上述兩項(xiàng)評(píng)分相加小于3分為陰性;3分為+;4～5分為++;6～7分為+++。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)及Fishers確切概率法檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX與Bcl-xl基因在不同宮頸組織表達(dá)比較 WWOX蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌陽性表達(dá)率分別為90.00%(9/10)、75.00%(15/20)、34.00%(17/50);Bcl-xl蛋白陽性表達(dá)率分別為 10.00%(1/10)、30.00%(6/20)、66.00%(33/50)。WWOX、Bcl-xl在宮頸鱗癌中陽性表達(dá)率與正常宮頸及宮頸上皮內(nèi)瘤變相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 WWOX與Bcl-xl基因在宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 WWOX及Bcl-xl基因在宮頸鱗癌中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 在50例宮頸鱗癌中，WWOX與Bcl-xl表達(dá)共陽性、共陰性均為10例，二者單獨(dú)陽性分別為7例和23例，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，表明WWOX與Bcl-xl在宮頸鱗癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= －0.164，P ＜0.05)。

3 討論

目前研究認(rèn)為惡性腫瘤是一種多基因性疾病，原癌基因激活、抑癌基因功能喪失及某些修飾基因功能的改變導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。具體來講，腫瘤的發(fā)生與致癌因子誘導(dǎo)染色體的常見脆性位點(diǎn)，進(jìn)而引起相關(guān)抑癌基因的失活有著較為密切的關(guān)系。WWOX基因［1］作為一個(gè)位于普通型脆性位點(diǎn)基因，它在射線、病毒、某些毒素的作用下均可能發(fā)生基因片段的變異或缺失，如果所變異或缺失的部分恰好是能夠抑制細(xì)胞異常生長增殖的基因，則這種變異和缺失可能抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，WWOX蛋白能夠與相關(guān)蛋白如p53、p73、ErbB4、c-jun、Ap-2 等結(jié)合，阻止后者進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制相關(guān)蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［2］。而這些相關(guān)蛋白均處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，說明WWOX在抑制蛋白轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中均有重要作用。多項(xiàng)研究［3～6］表明，WWOX蛋白表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，特別與上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌中WWOX陽性表達(dá)率均低于正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，推測(cè)WWOX的表達(dá)下降可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，WWOX陽性表達(dá)率隨著臨床分期增加，組織學(xué)分級(jí)增高逐漸下降;且在16例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中，WWOX表達(dá)缺失。提示W(wǎng)WOX在宮頸鱗癌中表達(dá)下降或缺失，可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要潛在因素，可能成為宮頸鱗癌早期診斷及判斷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

Bcl-xl屬Bcl-2基因家族成員之一，是一種凋亡抑制因子［7］。研究表明，Bcl-xl在許多腫瘤組織中表達(dá)升高，它能夠抑制抗腫瘤制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展;而用反義寡核苷酸抑制Bclxl的表達(dá)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］。本研究表明，在宮頸鱗癌組織Bcl-xl蛋白陽性表達(dá)率均高于正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織;且Bcl-xl陽性表達(dá)率隨著臨床分期增加、組織學(xué)分級(jí)增高及淋巴轉(zhuǎn)移逐漸升高，這說明Bcl-xl表達(dá)增高可能促進(jìn)了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

有文獻(xiàn)報(bào)道，WWOX通過下調(diào)凋亡抑制因子Bc1-xl和Bc1-2及上調(diào)p53的表達(dá)而增強(qiáng)TNF的細(xì)胞毒性功能，而TNF通過促使線粒體通透性的改變而導(dǎo)致WWOX從線粒體釋放入核內(nèi)，起到了促凋亡的作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在同一宮頸鱗癌組織中，WWOX陽性表達(dá)下調(diào)，而Bcl-xl蛋白陽性表達(dá)上調(diào)，二者呈明顯的負(fù)相關(guān)。因此推測(cè)，它們?cè)趯m頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程中可能共同存在、共同發(fā)揮作用，兩者可能通過上述機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制，從而促進(jìn)宮頸鱗癌的發(fā)生及進(jìn)展，有望作為檢測(cè)宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展及判斷預(yù)后的又一腫瘤生物學(xué)指標(biāo)。

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