張榮泉，呂方，趙亞新，羅威 ，郭大生

（1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.天津市新天馬企業(yè)發(fā)展有限公司，天津 300221）

硒是人和動物所必需的微量元素，有多種重要的生物學(xué)功能。硒幾乎存在于所有免疫細(xì)胞中，補(bǔ)充硒可提高機(jī)體免疫力，從而起到防病的效果。自然界中，以0價態(tài)存在的硒是單質(zhì)硒，難以被生物吸收利用，生物學(xué)作用極低；無機(jī)硒中硒的價態(tài)是4+，6+，常見的這類化合物有Na2SeO3，Na2SeO4；有機(jī)硒中硒的價態(tài)通常是以－2存在，或者是與其他物質(zhì)以絡(luò)合態(tài)存在。硒的毒性就依賴于其化學(xué)形式[1]。

有機(jī)硒，特別是通過植物、微生物轉(zhuǎn)化富集的有機(jī)硒，具有毒性低、吸收率高、生物利用率高及對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。

麥苗具有的營養(yǎng)價值要大于麥籽粒，利用其種芽生長代謝迅速，營養(yǎng)轉(zhuǎn)化較快的特點(diǎn)，可將無機(jī)硒富集轉(zhuǎn)化成為有機(jī)硒，有研究報道，這種富硒大麥苗的原汁可以提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和抗雞紅細(xì)胞抗體的效價等免疫功能指標(biāo)[2]。富硒麥芽干粉還含一定量VE和VC前體，其毒性試驗顯示急性毒性為實(shí)際無毒，三項致突變試驗均為陰性結(jié)果[3]。

為便于保存，方便食用，本實(shí)驗將富硒麥芽苗的干粉為原料，制備成富硒麥芽沖劑，通過動物試驗觀察富硒麥芽沖劑對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

富硒麥芽沖劑：批號 20110706，Se 0.667 mg/kg，天津市醫(yī)藥研究開發(fā)公司生產(chǎn)；MTT、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液：Gibco公司；小牛血清：中科院血液學(xué)研究所；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、Hank's液、雞紅細(xì)胞、Giemsa染液、PBS緩沖液、LDH基質(zhì)液、HCI、YAC-1細(xì)胞等。

1.2 實(shí)驗動物

SPF級昆明種小鼠（雌性，160只，體重 18 g～22 g）：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供，合格證號：SCXK-（軍）2009-003 0000371。

1.3 方法

動物免疫功能實(shí)驗方法按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）》規(guī)定進(jìn)行[4]。

1.3.1 劑量選擇和分組

本試驗設(shè)3個劑量組，分別為1.0 g/kg·BW（低劑量組）、2.0 g/kg·BW（中劑量組）、4.0 g/kg·BW（高劑量組），各組分別稱取富硒麥芽沖劑10.0、20.0、40.0g，加蒸餾水至200 mL，混合均勻；每天灌胃一次，每次0.2 mL/10g·BW，對照組給予等量蒸餾水，連續(xù)30 d，末次給受試物后24 h測定各項指標(biāo)。

將小鼠隨機(jī)分為4個大組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），每大組40只小鼠，每大組小鼠又分為4個小組，分別為對照組和低、中、高3個劑量組，每組10只；Ⅰ組進(jìn)行HC50測定、抗體生成細(xì)胞檢測和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；Ⅱ組進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞實(shí)驗和臟器/體重比值測定；Ⅲ組進(jìn)行碳廓清實(shí)驗；Ⅳ在進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗和NK細(xì)胞活性測定。

1.3.2 半數(shù)溶血值（HC50）的測定

給予受試物第25天后，每只動物腹腔注射2%SRBC0.2 mL，再繼續(xù)給受試物至第30天時，眼內(nèi)眥取血，離心收集血清，SA緩沖液稀釋300倍。管內(nèi)加入1 mL稀釋的血清、0.5 mL 10%SRBC和1 mL補(bǔ)體。另設(shè)不加血清對照管，37℃水浴20 min后，冰浴終止反應(yīng)。離心取1 mL上清，加3 mL都氏試劑為樣品管，同時加25 mL 10%SRBC加都氏試劑至4 mL用以測定SRBC半數(shù)溶血時的光密度值，充分混勻，放置10 min后，540 nm處測定各管光密度值。

1.3.3 抗體生成細(xì)胞檢測

給予受試物第25天后，每只動物腹腔注射2%SRBC的0.2 mL，繼續(xù)給予受試物第30天后，脫臼處死小鼠取脾臟，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL。將表層培養(yǎng)基加熱溶解，45℃水浴保溫，與等量2倍濃度Hank's液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，加入50 μL 10%SRBC，20 μL 脾細(xì)胞懸液，混勻倒片，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h～1.5 h，加入用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體（1∶10），繼續(xù)培養(yǎng)1 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

抗體生成細(xì)胞數(shù)（103/全脾）=觀察空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)（400）/1 000

1.3.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）

給予受試物第25天后，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC，再繼續(xù)給受試物至第30天時測量左后足距部厚度，同時在測量部位注射20 μL 20%SRBC，注射24 h后測量左后足距部厚度，同一部位測量三次，取平均值。

攻擊前后足趾厚度差值（mm）=攻擊后足趾厚度-攻擊前足趾厚度

1.3.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞實(shí)驗（半體內(nèi)法）

給予受試物第32天，各組小鼠腹腔注射1mL20%雞紅細(xì)胞懸液，30 min后頸椎脫臼處死小鼠，腹腔注射生理鹽水2 mL，按揉腹壁1 min，吸出1 mL腹腔洗液，分滴于2片載玻片，置37℃孵育30 min，沖洗、固定，Giemsa染液染色計數(shù)。每張片計數(shù)100個，按照下式計算吞噬指數(shù)和吞噬百分率[9]：

1.3.6 臟器/體重比值測定

給予受試物第30天，取胸腺、脾臟，分別稱出胸腺、脾臟重量，計算臟器/體重比值。

1.3.7 小鼠碳廓清實(shí)驗

給予受試物31 d后，尾靜脈注射3.5倍稀釋的印度墨汁（0.1 mL/10 g·BW），分別于第 2、10分鐘眼內(nèi)毗取血20μL，加入到2.98mL0.1%碳酸鈉溶液中，600nm處測定各管光密度值。另取肝、脾稱重，按下式計算吞噬指數(shù)。

1.3.8 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）

給予受試物33 d，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液。用Hank's液洗3次，每次1 000 r/min離心10 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL，并將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔 1 mL，一孔加75 μL ConA液（100 μg/mL），另一孔為對照，置 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)72 h。結(jié)束前，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)束后，分裝 96孔培養(yǎng)板中，每個孔作3個平行孔，用酶標(biāo)儀以570 nm波長測定光密度值。按下式計算光密度差值。

光密度（ABS）差值=加ConA孔光密度-未加ConA孔光密度

1.3.9 NK細(xì)胞活性測定（乳酸脫氫酶測定法）

試驗前24小時將YAC-1細(xì)胞（靶細(xì)胞）進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL（效靶比50∶1），加入96孔培養(yǎng)板，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40各100 μL，設(shè)3個平行孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔吸取上清液100 μL置96孔培養(yǎng)板中，同時加入100 μL LDH基質(zhì)液，反應(yīng)3 min，每孔加入30 μL 1mol/L的HCl，在酶標(biāo)儀492 nm按下式計算NK細(xì)胞活性：

1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用SPSS11.5 for windows進(jìn)行統(tǒng)計分析，對照組與實(shí)驗組采用方差分析，如方差不齊者采用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后仍不齊采用非參數(shù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒麥芽沖劑對小鼠體重的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠體重的影響，見表1。

表1 受試物對免疫Ⅰ組小鼠體重增重的影響（g，±s）Table 1 The impact of test sample on weight gain of mice in ImmuneⅠgroup（g，x ±s）

表1 受試物對免疫Ⅰ組小鼠體重增重的影響（g，±s）Table 1 The impact of test sample on weight gain of mice in ImmuneⅠgroup（g，x ±s）

組別 劑量/（g/kg·BW）ⅠⅡⅢⅣ（n=10）對照組 0 16.4±1.0 16.3±1.0 16.7±1.1 16.3±0.7低劑量組 1.0 16.2±0.7 16.4±0.9 16.7±1.1 16.2±1.2中劑量組 2.0 16.7±0.6 15.9±0.7 16.0±0.9 16.6±0.9高劑量組 4.0 16.1±0.8 16.9±0.8 16.2±0.7 16.4±0.5（n=10） （n=10） （n=10）

由表1可見，經(jīng)口給予不同劑量的富硒麥芽沖劑30 d后，各組動物生長活動良好，各劑量組動物增重與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 富硒麥芽沖劑對小鼠臟器/體重比值的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠臟器/體重比值的影響，見表2。

由表2可見，各劑量組動物脾臟、胸腺與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 受試物對小鼠臟器/體重比值的影響（±s）Table 2 The impact of test sample on organ/body weight ratio of mice（±s）

表2 受試物對小鼠臟器/體重比值的影響（±s）Table 2 The impact of test sample on organ/body weight ratio of mice（±s）

脾臟/體重比值/%對照組 0 10 27.5±1.6 39.8±2.9低劑量組 1.0 10 28.2±2.0 39.1±3.2中劑量組 2.0 10 26.9±2.6 40.1±2.6高劑量組 4.0 10 27.8±1.4 38.5±3.1組別 劑量/（g/kg·BW） 動物數(shù)/只 胸腺/體重比值/%

2.3 富硒麥芽沖劑對體液免疫的影響

2.3.1 富硒麥芽沖劑對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響，見表3。由表3可見，高劑量組的小鼠半數(shù)溶血值（HC50）高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），中、低劑量組小鼠半數(shù)溶血值（HC50）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 受試物對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（g，平均值±s）Table 3 The impact of test sample on half hemolysis value（HC50）of mice（±s）

表3 受試物對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（g，平均值±s）Table 3 The impact of test sample on half hemolysis value（HC50）of mice（±s）

注：*與對照組比較P＜0.05。

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只HC50對照組 0 10 170.9±24.5低劑量組 1.0 10 176.7±15.0中劑量組 2.0 10 193.9±24.9高劑量組 4.0 10 216.9±27.3

2.3.2 富硒麥芽沖劑對小鼠抗體生成細(xì)胞試驗的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠抗體生成細(xì)胞試驗的影響，見表4。

表4 受試物對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響（±s）Table 4 The impact of test sample on the antibody-producing cells of mice（±s）

注：*與對照組比較P＜0.05。

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只溶血空斑數(shù)（×103/全脾）對照組 0 10 34.4±10.7低劑量組 0.25 10 41.6±12.7中劑量組 0.50 10 46.8±10.5*高劑量組 1.00 10 49.7±8.7*

由表4可見，中、高劑量組的小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 富硒麥芽沖劑對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.4.1 富硒麥芽沖劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足距增厚法）的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足距增厚法）的影響，見表5。

表5 受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足距增厚法）的影響（±s）Table 5 The impact of test sample on the delayed allergy of mice（foot from thickening method）（±s）

表5 受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足距增厚法）的影響（±s）Table 5 The impact of test sample on the delayed allergy of mice（foot from thickening method）（±s）

注：*與對照組比較P＜0.05。

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只攻擊前后足趾厚度差值/mm對照組 0 10 0.37±0.09低劑量組 1.0 10 0.39±0.11中劑量組 2.0 10 0.43±0.07高劑量組 4.0 10 0.49±0.08*

由表5可見，高劑量組的小鼠攻擊前后足趾厚度差值高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），中、低劑量組小鼠攻擊前后足趾厚度差值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4.2 富硒麥芽沖劑對ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）的影響

富硒麥芽沖劑對ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）的影響，見表6。

表6 受試物對ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的影響（±s）Table 6 The impact of test sample on the mice splenic lymphocyte transformation by ConA induction（±s）

表6 受試物對ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的影響（±s）Table 6 The impact of test sample on the mice splenic lymphocyte transformation by ConA induction（±s）

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只光密度差值對照組 0 10 0.247±0.032低劑量組 1.0 10 0.260±0.038中劑量組 2.0 10 0.251±0.032高劑量組 4.0 10 0.274±0.022

由表6可見，低、中、高三個劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 富硒麥芽沖劑對單核一巨噬細(xì)胞功能的影響

2.5.1 富硒麥芽沖劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗的影響，見表7。

表7 受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗的影響（±s）Table 7 The impact of test sample on the mice peritoneal macrophage phagocytosing chicken red blood cell test（±s）

表7 受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗的影響（±s）Table 7 The impact of test sample on the mice peritoneal macrophage phagocytosing chicken red blood cell test（±s）

組別 劑量/（g/kg·BW） 動物數(shù)/只 動物數(shù)吞噬百分率/% 吞噬指數(shù)對照組 0 10 23.7±4.6 0.274±0.041低劑量組 0.25 10 24.6±5.1 0.286±0.055中劑量組 0.50 10 25.1±4.9 0.291±0.045高劑量組 1.00 10 22.5±3.5 0.269±0.031

由表7可見，三個劑量組小鼠的吞噬百分率及吞噬指數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5.2 富硒麥芽沖劑對小鼠碳廓清試驗的影響

富硒麥芽沖劑對小鼠碳廓清試驗的影響，見表8。

表8 受試物對小鼠碳廓清試驗的影響（±s）Table 8 The impact of test sample on mice carbon clearance test（±s）

表8 受試物對小鼠碳廓清試驗的影響（±s）Table 8 The impact of test sample on mice carbon clearance test（±s）

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只吞噬指數(shù)a對照組 0 10 5.80±0.88低劑量組 0.25 10 5.98±1.02中劑量組 0.50 10 6.21±0.85高劑量組 1.00 10 5.94±0.65

由表8可見，低、中、高三個劑量組的小鼠吞噬指數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 富硒麥芽沖劑對NK細(xì)胞活性的影響

富硒麥芽沖劑對NK細(xì)胞活性的影響，見表9。

表9 受試物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（乳酸脫氫酶測定法）（±s）Table 9 The impact of test sample on the activity of natural killer cells in mice（lactate dehydrogenase assay）（±s）

表9 受試物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（乳酸脫氫酶測定法）（±s）Table 9 The impact of test sample on the activity of natural killer cells in mice（lactate dehydrogenase assay）（±s）

注：*與對照組比較P＜0.05。

組別劑量/（g/kg·BW）動物數(shù)/只NK細(xì)胞活性/%對照組 0 10 20.9±6.1低劑量組 0.25 10 19.1±7.9中劑量組 0.50 10 31.7±7.1*高劑量組 1.00 10 32.7±10.2*

由表9可見，NK細(xì)胞活性檢測顯示中、高劑量組的NK細(xì)胞活性高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組的NK細(xì)胞活性與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

經(jīng)口給予不同劑量的富硒麥芽沖劑30 d后，各組動物生長活動正常。小鼠半數(shù)溶血值（HC50）試驗顯示，高劑量組的半數(shù)溶血值（HC50）高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；小鼠抗體生成生成試驗顯示，中、高劑量組的小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗顯示，高劑量組小鼠攻擊前后足距厚度差值高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NK細(xì)胞活性檢測顯示，中、高劑量組NK細(xì)胞活性高于對照組（P＜0.05）。其它各項試驗未見免疫抑制現(xiàn)象。

3 結(jié)果與討論

植物中存在的有機(jī)硒主要是硒蛋氨酸，與無機(jī)硒源亞硒酸鈉相比，不具有氧化性，且在機(jī)體組織內(nèi)沉留率較高，安全范圍較大。秦秦的研究結(jié)果顯示，富硒麥芽的有機(jī)硒，毒性低于亞硒酸鈉[2]。

研究認(rèn)為，硒在機(jī)體內(nèi)有兩個代謝庫，硒蛋氨酸（Se-Mef）庫和其它形式硒庫。硒蛋氨酸可儲存于“Se-Mef庫”中，其他形式的硒不能轉(zhuǎn)化為Se-Mef儲存體內(nèi)，因此欲維持機(jī)體有一定量的硒儲備，用硒蛋氨酸形式為佳。目前已測定出小麥、玉米和酵母等所含的硒，以硒蛋氨酸形式為主。植物中的有機(jī)硒種類很多，可從中篩選出安全有效的原料或添加劑[5-6]。

富硒麥芽與其它硒產(chǎn)品比較，除含硒外，還含有膳食纖維、胡蘿卜素、尼克酸和維生素、葉綠素等活性物質(zhì)，特別還含有豐富的酶。富硒麥芽中的酶提高所含硒的吸收利用率，又增強(qiáng)所含硒的生理功能，硒和酶的相互協(xié)同作用。

已有富硒麥芽對腫瘤方面的作用研究報道[7-9]，對小鼠免疫功能方面研究的報道使用的是新鮮富硒大麥苗原汁[2]，與富硒麥芽原汁、富硒麥芽粉比較，將富硒麥芽粉制備成富硒麥芽沖劑，功效成分含量差異較小，使硒的食用劑量準(zhǔn)確安全可控；服用方便，特別適合有吞咽障礙或困難的人群，使用者服用的依從性好；便于保存、攜帶和運(yùn)輸。

本試驗以富硒麥芽粉為原料，制備成富硒麥芽沖劑，進(jìn)行動物試驗觀察其對免疫功能的影響。結(jié)果顯示：富硒麥芽沖劑對小鼠體液免疫作用明顯，體液免疫指標(biāo)，半數(shù)溶血值（HC50）測定中的高劑量組及抗體生成細(xì)胞檢測中的中、高劑量組結(jié)果均高于對照組（P＜0.05）；在細(xì)胞免疫指標(biāo)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗顯示，高劑量組小鼠攻擊前后足距厚度差值高于對照組（P＜0.05）；在NK細(xì)胞活性檢測的中、高劑量組結(jié)果均高于對照組（P＜0.05）；其它各項試驗未見免疫抑制現(xiàn)象；富硒麥芽為原料制備的富硒麥芽沖劑，同樣具有增強(qiáng)動物免疫力功能的作用。

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