張茜茜， 李 紅， 陳 麗， 陳 慶， 劉升明

(1.河南省人民醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450000;暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院;2.病理科，3.呼吸科，廣東廣州510630)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的特征為持續(xù)存在的氣流受限，且呈進行性發(fā)展，伴有有害顆?；驓怏w對氣道和肺所致慢性炎癥反應(yīng)的增加［1］。COPD作為一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病、多發(fā)病，具有較高的死亡率和致殘率，然而其發(fā)病機制至今尚未完全闡明，臨床治療效果亦欠佳，缺乏有效的方法來逆轉(zhuǎn)COPD的進展。抵抗素樣分子(resistin like molecules，RELMs)是2000年發(fā)現(xiàn)的一個富含半胱氨酸的分泌蛋白家族［2］，共有4 個成員:RELMα/FIZZ1/HIMF、RELMβ/FIZZ2、resistin/FIZZ3、RELMγ/FIZZ4;其中 RELMβ和resistin是在人體內(nèi)表達的抵抗素家族成員［3］。RELMβ作為缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子的類似物，特異表達于肺組織，具有促進肺部炎癥、誘導(dǎo)膠原沉積、對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞具有促有絲分裂作用及刺激成纖維細(xì)胞遷移等功能［4－5］。目前對其研究主要集中在實驗性哮喘模型、缺氧性肺血管重塑及肺動脈高壓等肺部疾病。本組對COPD患者支氣管肺組織中RELMβ的分布和表達進行了研究，從臨床角度探討RELMβ在COPD發(fā)生與發(fā)展中的作用。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年3月～2010年9月因肺癌入院行肺葉切除術(shù)的患者19例，均未經(jīng)放療和化療，并且無COPD以外的其他肺部疾病及其他系統(tǒng)的慢性疾病。根據(jù)2007年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會 COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，將其分為COPD組和對照組，兩組的一般臨床資料見表1。實驗所需的肺組織均取自遠離原發(fā)灶5 cm以上，肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺組織，部分肺組織存放于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一部分肺組織標(biāo)本常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2 研究方法

(1)HE染色 取石蠟切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，常規(guī)HE染色。

表1 兩組研究對象一般臨床資料比較Table 1 The comparison of general clinical data between two subjects

表1 兩組研究對象一般臨床資料比較Table 1 The comparison of general clinical data between two subjects

1)FEV1:一秒鐘用力呼氣容積;2)FEV1%預(yù)計值:3)FEV1占預(yù)計值的百分比;4)FVC%預(yù)計值:用力肺活量占預(yù)計值的百分比.

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(2)免疫組織化學(xué)檢測RELMβ的表達 參照福州邁新試劑盒推薦的鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶(SP)法免疫組化步驟進行操作。一抗為多克隆兔抗人RELMβ抗體(美國Abcam公司)，稀釋比例1∶1 000，二抗為生物素化兔抗羊IgG抗體。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對照使用人結(jié)腸癌組織。陽性表達為細(xì)胞漿呈棕褐色或棕黃色顆粒樣改變。用Image Pro-Plus顯微圖像分析系統(tǒng)分別測定每張切片陽性顆粒的平均吸光度值(A值)，進行分析處理。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

(3)Western blot法檢測RELMβ蛋白的表達使用組織細(xì)胞裂解液，冰上操作，提取每個樣本的總蛋白后加入1∶5稀釋的十二烷基硫酸鈉(SDS)，經(jīng)高溫使蛋白完全變性、解聚，－20℃保存?zhèn)溆?。每個樣本的上樣量為50 μg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，濃縮膠80 V，分離膠100 V，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)轉(zhuǎn)膜，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜30 min，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與針對 RELMβ(1∶500 滴度)、β-actin(1∶1 000 滴度)的一抗 4 ℃孵育過夜;加入二抗室溫孵育2 h，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG。ECL化學(xué)發(fā)光試劑工作液進行蛋白信號檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Levene法行方差齊性檢驗。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，相關(guān)性采用Pearson等級相關(guān)分析。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

(1)免疫組化檢測RELMβ蛋白表達 RELMβ蛋白表達于胞漿中。結(jié)腸癌陽性對照組RELMβ呈強陽性表達。COPD組呈中等程度表達，主要位于肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及散在的炎癥細(xì)胞的胞漿中。而肺功能正常組RELMβ蛋白呈弱陽性表達。與肺功能正常組(0.386±0.072)相比，COPD組各種細(xì)胞陽性著色表達明顯增強(2.657±0.387)(P＜0.01)，見表2、圖1－5。

(2)Western blot檢測RELMβ蛋白含量 可見RELMβ條帶在陽性對照組、COPD組和肺功能正常組表達呈依次下降，其表達趨勢與免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果一致，見圖6。

(3)相關(guān)性分析 COPD組支氣管肺組織中RELMβ的表達與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.993，P＜0.01)，與1秒鐘用力呼吸容積%(FEV1%)預(yù)計值、FEVI/FVC均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為－0.782和－0.632;P值均＜0.05)。

圖1 －5 肺組織中RELMβ蛋白的表達Fig.1 －5 The expression of RELMβprotein in the lung tissue

表2 肺組織內(nèi)RELMβ蛋白的表達Table 2 The expression of RELMβ protein in the lung

表2 肺組織內(nèi)RELMβ蛋白的表達Table 2 The expression of RELMβ protein in the lung

1)與肺功能正常組比，P＜0.01.

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圖6 Western blot檢測組織內(nèi)RELMβ的表達Fig.6 Western blot shows the expression of RELMβ in the lung

3 討論

RELMs(Resistin like molecules)是2000年發(fā)現(xiàn)的一個新基因家族，由105－114個氨基酸組成，有3個結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端信號肽、中間可變區(qū)和相對保守的富含11個半胱氨酸的C端序列［6］。該家族的每個成員都有獨特的組織分布及嚴(yán)格的生物學(xué)功能。RELMα也被稱作缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子(HIMF)，在嚙齒類動物的肺組織內(nèi)特異性表達;RELMβ起初是一種腸源性的分泌激素維持胃腸道屏障功能的蛋白［2］，后研究發(fā)現(xiàn)其與缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子在氨基酸序列相似性達58.6%，序列同源性為49.6%。HIMF作為一種新的多效性細(xì)胞因子，兼具有炎癥因子和生長因子的特性，如刺激肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、收縮血管、抗凋亡、生成血管及刺激肌纖維母細(xì)胞分化等功能，在多種肺部疾病模型中具有重要意 義［7－8］。Zimmermann 等［9］進 一 步 研 究 發(fā) 現(xiàn)，RELMβ作為哮喘標(biāo)記基因組的一員，是參與粘膜固有炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。并作為一種促增殖因子，可能在缺氧性肺血管重塑所致肺動脈高壓及與缺氧相關(guān)的肺纖維化中起作用［4］。近期 Angelini等［10］發(fā)現(xiàn)RELMβ在系統(tǒng)性硬化癥所致的肺動脈高壓內(nèi)持續(xù)表達，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及α平滑肌肌動蛋白內(nèi)呈陽性表達，并在巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞內(nèi)均可見表達。因此，RELMβ作為HIMF的類似物，特異表達于肺組織，具有促進肺部炎癥、誘導(dǎo)膠原沉積、對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞具有促有絲分裂作用及刺激成纖維細(xì)胞遷移等功能［4，10］。

COPD是以氣道、肺實質(zhì)、肺血管的慢性炎癥及炎癥性損傷和修復(fù)造成氣道重塑改變?yōu)榛静±硖卣鳎蚨鴱睦碚撋贤茰y，RELMβ可能參與COPD的慢性炎癥反應(yīng)和早期氣道重塑，但目前無相關(guān)研究報道。本實驗結(jié)果證實，在正常支氣管粘膜中可觀察到有限的RELMβ蛋白表達，而在COPD肺部炎癥損傷的支氣管粘膜中RELMβ陽性顆粒在肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及散在的炎癥細(xì)胞的胞漿中呈中等程度的表達，尤以肺泡上皮細(xì)胞為主，此結(jié)果提示RELMβ可能參與了COPD的慢性氣道炎癥，且其表達所在的肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞部位與 Zimmermann［9］和 Angelini［10］研究哮喘和系統(tǒng)性硬化癥的表達結(jié)果一致。

眾所周知，吸煙是COPD最重要的危險因素，我國吸煙者COPD的患病率明顯高于非吸煙者。本實驗結(jié)果顯示，COPD患者的吸煙指數(shù)顯著高于肺功能正常組(P＜0.05);COPD患者肺內(nèi)RELMβ的表達與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)，與氣流受限程度(FEV1%預(yù)計值)呈負(fù)相關(guān)，提示吸煙產(chǎn)生的有毒顆粒和氣體可能趨化RELMβ炎癥介質(zhì)的表達，加重COPD的氣道炎癥。

RELMβ作為一個肺組織內(nèi)特異性表達的炎癥介質(zhì)，目前對該成員的功能及其調(diào)控機制還處于初步研究階段。COPD患者RELMβ表達的增加，這種現(xiàn)象可能提示RELMβ可能作為一種炎癥因子參與COPD的發(fā)生發(fā)展。進一步闡明RELMβ在COPD慢性氣道炎癥中的作用，有助于COPD的防治研究。由于本組標(biāo)本收集所限，未能對COPD患者進行分層分析，尚不能確定其表達增加是否與病情相關(guān)，這些還有待于深入研究。

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