孫 巍 談 智 徐 燕 吳曉松 王 嵬

江蘇省疾病預防控制中心，南京 210009

結核是世界上最古老、分布最廣泛的疾病之一，曾嚴重危害人類的健康。近年來由于人口流動以及多發(fā)耐藥菌株增多等多種因素，結核病再次成為全球關注的重要公共衛(wèi)生問題和社會問題，WHO已將結核病作為重點控制的傳染病之一，并宣布全球結核病處于緊急狀態(tài)。我國是世界上22個結核病高發(fā)國家之一，居全球第二位，結核分枝桿菌感染導致的疾病一直嚴重威脅著人類的健康，仍然是我國重點防治的重大傳染性疾病[1～3]。

當前結核病感染發(fā)病率高，病死率高、耐藥等原因導致治愈率低。殺滅自然環(huán)境中結核桿菌是控制結核病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。目前國內外相繼出現(xiàn)了大量的結核分枝桿菌引起醫(yī)院內感染的報道，而引起醫(yī)院內感染增加的原因，除了生物因素、環(huán)境因素和營養(yǎng)因素外，醫(yī)院消毒的不合理、不規(guī)范也是一個重要原因，消毒劑不合理使用，在殺滅細菌的同時，也誘導其產生對消毒劑的抗性，尤其是2003年SARS危機后，盲目使用消毒劑，不僅造成了消毒劑的浪費，環(huán)境的污染，同時也造成了一些微生物對消毒劑抗性的產生，研究資料表明，醫(yī)院感染病原體的耐受現(xiàn)象已不僅僅局限于抗生素，開始擴展到了消毒劑。且隨著消毒劑的大量使用變得越來越廣泛，后果也越來越嚴重，尤其在醫(yī)院感染的傳播中，對消毒劑的耐受可能是重要因素之一[3～5]。

因此，本研究選擇醫(yī)院常用消毒劑碘伏為研究對象，觀察碘伏作用結核桿菌標準菌株以及從臨床病人中分離出來的耐多藥的菌株的殺滅效果，了解結核桿菌對常用消毒劑的抗性變化，并對6株細菌進行耐消毒劑基因的分子生物學檢測。

材料與方法

試驗材料

1. 試驗菌株

結核桿菌標準菌株H37Rv（中國疾控中心國家結核病參比實驗室），結核桿菌標準菌株H37Ra（中國疾控中心國家結核病參比實驗室），結核桿菌臨床分離耐多藥菌株：耐多藥菌株a（利福平、異煙肼耐藥）；耐多藥菌株b（利福平、異煙肼、乙胺丁醇耐藥）；耐多藥菌株c（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）；耐多藥菌株d（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）（江蘇省疾病預防控制中心結核實驗室提供）。

2. 消毒液

碘伏消毒液（聚乙烯吡咯烷酮碘，有效碘含量為5.4g/L）。

3. 試劑

5g/L硫代硫酸鈉、10g/L吐溫-80的TSB液，3%牛血清白蛋白，改良羅氏培養(yǎng)基等。

4. 器材

機械秒表（504型），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（熱電-710L）等。

方法

1.菌懸液的制備

1）結核桿菌標準菌株H37Rv

在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80水溶液，用無菌吸管尖端或火焰消毒的接種環(huán)刮取2～3周的新鮮菌落，至于磨菌瓶中；注意盡可能刮取斜面各個部位的菌落，避免挑取1～2個單獨菌落進行試驗，刮取菌落的量以半環(huán)或一環(huán)（5mg～10mg）為宜；旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～30秒；靜置5分鐘，小心打開瓶蓋，加入約2毫升滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質沉淀；用無菌吸管吸取中上部的菌液，約1毫升，轉移到另一無菌試管中，與麥氏比濁管比濁；逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁度與標準麥氏比濁管一致，即得到1mg/mL的菌液；上述操作需在Ⅱ級或Ⅱ級以上生物安全操作柜中進行。

2） 結核桿菌標準菌株H37Ra

同1）步驟。

3）結核桿菌臨床分離耐多藥菌株

同1）步驟。

2. 中和劑選擇試驗

參照消毒技術規(guī)范（2002版）[2]，設平行6組試驗，按懸液定量殺菌試驗程序進行。

1）消毒液+菌懸液；

2）（消毒液+菌懸液）+中和劑；

3）中和劑+菌懸液；

4）（消毒液+中和劑）+菌懸液；

5）稀釋液+菌懸液（正常菌對照）；

6）稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基作為陰性對照。

試驗結果，以第1組不長菌或僅有極少數(shù)菌落生長；第2組有菌落生長，較第1組為多，但較第3、4、5組為少；第3、4、5組組間菌落數(shù)在1×107CFU/mL ～ 5×107CFU/mL，誤差率不超過15%；第6組無菌生長。表明所選中和劑及其濃度適宜。

3. 懸液定量殺菌實驗

用無菌硬水配制試驗濃度的碘伏消毒液（陽性對照為稀釋液），取0.5mL菌懸液和0.5mL有機干擾物（3%牛血清白蛋白）在20℃±1℃水浴5min，再加入4.0mL消毒液，作用一定時間，取0.5mL混和液加入4.5mL中和劑，中和作用10min，取0.1mL加入改良羅氏平板培養(yǎng)基，用L棒涂抹均勻，培養(yǎng)1個月。試驗重復3次。

4. 耐消毒劑基因的檢測

1）qacE△1-sulI基因檢測

引物P1：5’-T AGCGAGGGCTTT ACCT AAGC-3’，P2：ATTCAGAATGCCGAACACCG，擴增產物長度300bp，引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應體系如下：

反應：體積25uL，dNTPs的濃度各為200Lmol/L，引物濃度均為0.6Lmol/L，含TaqDNA聚合酶2U, 10倍的反應緩沖液2.5uL，DNA模板為3uL。93℃預變性2min后，進行35個循環(huán), 每次循環(huán)93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s。35次循環(huán)結束后于72℃延伸5min。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳30min，電壓110V，觀察結果。

2）qacA/B基因檢測

引物P1：5’- CT A TGGCAA T AGGAGA T A TGGTGT-3’，P2：5’- CCACT ACAGA TTCTTCAGCT ACA TG-3’，產物長416bp。引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反應體系及電泳條件：同1）。

結果

中和劑鑒定試驗

結果表明，含5g/L硫代硫酸鈉、10g/L吐溫-80的中和劑，可以有效中和含有效碘1000mg/L濃度的消毒液對龜分枝桿菌膿腫亞種的殘留作用，中和劑及其產物對試驗菌生長和培養(yǎng)基無不良影響，符合有效中和劑結果判定要求。含5g/L硫代硫酸鈉、5g/L吐溫-80的中和劑，可以有效中和含有效碘500mg/L濃度的消毒液對結核桿菌標準菌株H37Rv和H37Ra的殘留作用，中和劑及其產物對試驗菌生長和培養(yǎng)基無不良影響，符合有效中和劑結果判定要求（見表1）。

對結核桿菌標準菌株H37Rv的殺滅效果

研究結果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用7min，有效碘250mg/L的消毒液作用3min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min對結核桿菌標準菌株H37Rv殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時間延長，殺滅效果逐漸遞增（見表2）。

對結核桿菌標準菌株H37Ra的殺滅效果

研究結果表明，含有效碘250mg/L的消毒液作用5min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min，對結核桿菌標準菌株H37Ra殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時間延長，殺滅效果逐漸遞增（見表3）。

對多株臨床分離的多株耐多藥菌株的殺滅效果

1. 耐多藥菌株a（利福平、異煙肼耐藥）；

研究結果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用1min 、500mg/L的消毒液作用1min，對耐多藥株a殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時間延長，殺滅效果逐漸遞增（見表4）。

表1 中和劑鑒定試驗結果

表2 對結核桿菌標準菌株H37Rv殺滅效果

表3 對結核桿菌標準菌株H37Ra殺滅效果

2. 耐多藥菌株b（利福平、異煙肼、乙胺丁醇耐藥）

研究結果表明，含250mg/L的消毒液作用1min，對耐多藥株b殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加，殺滅效果逐漸遞增，作用時間的影響相對較?。ㄒ姳?）。

3. 耐多藥菌株c（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）；

研究結果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，對耐多藥菌株c殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時間延長，殺滅效果逐漸遞增（見表6）。

4.耐多藥菌株d（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）

研究結果表明，含有效碘125mg/L的消毒

液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，對耐多藥菌株d殺滅對數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時間延長，殺滅效果逐漸遞增（見表7）。

表4 對耐多藥菌株a殺滅效果

表5 對耐多藥菌株b殺滅效果

表6 對耐多藥菌株c殺滅效果

耐消毒劑基因的檢測

1. 經PCR檢測證明，2株標準菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacE△1-sulI基因的PCR檢測，標準菌株H37Rv、耐多藥菌株a、耐多藥菌株b為陽性，陽性率50%（見圖1）。

2. 經PCR檢測證明， 2株標準菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacA/B基因PCR檢測皆為陰性，均未檢測到抗消毒劑基因。

討論

目前，用于結核病治療的一線藥物主要有：利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇等，其中，利福平和異煙肼是應用于臨床的主要藥物，至少對這兩種藥物耐藥，評判該臨床菌株為耐多藥菌株，因此，本研究選取結核桿菌標準菌株H37Rv、結核桿菌標準菌株H37Ra、以及4株耐多藥菌株為代表。而碘伏廣泛應用于臨床消毒，屬于廣譜、中效消毒劑，其殺菌作用較強，作用速度快，且對皮膚黏膜刺激較小[6]。

圖1 qacE△1-sulI基因PCR電泳圖

表7 對耐多藥菌株d殺滅效果

本研究結果表明，含有效碘250mg/L作用5min、500mg/L作用1min，對結核桿菌標準菌株H37Rv殺滅對數(shù)值＞4.00，含有效碘500mg/L作用1min，對結核桿菌標準菌株H37Ra殺滅對數(shù)值＞4.00，含有效碘250mg/L作用3min，對4株耐多藥菌株殺滅對數(shù)值均＞4.00?？梢?，碘伏消毒液對結核桿菌標準菌株以及耐多藥菌均有良好的殺菌作用，可以提倡應用于醫(yī)院及高危環(huán)境中醫(yī)護人員或病人及家屬的皮膚表面的消毒，可減少交叉感染，降低及醫(yī)院感染的發(fā)生，有效控制結核病的傳播和流行。

經PCR檢測證明，2株標準菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacE△1-sulI基因的PCR檢測，標準菌株H37Rv、耐多藥菌株a、耐多藥菌株b為陽性，陽性率50%。耐消毒基因qacA/B基因的PCR檢測皆為陰性，均未檢測到該抗消毒劑基因。

[1]王濤，王仲元，唐靜等.結核桿菌對纖維支氣管鏡的污染及其消毒的研究.中國消毒學雜志.2009；26（6）：632-635.

[2]程萍，陳月，蔣紅梅.三種常用消毒液對結核分枝桿菌殺滅效果的對比[J].貴陽醫(yī)學院學報，2005，30（5）：66.

[3]Falkinham JO 3rd. Epidem iology of infection by non turberculous mycobacteria[J].Clin M icrobiol Rev，1996，9（2）：177-215.

[4]申阿東，楊永弘，江載芳.結核分枝桿菌耐藥性的分子機制研究進展[J].國際兒科學雜志，2006，33（3）：153-155.

[5]李召東，陳瑜，王明法.結核桿菌耐藥的分子機制研究[J].中國醫(yī)藥導報，2007，4（2）：15-17.

[6]薛廣波等.現(xiàn)代消毒學[M].北京，人民軍醫(yī)出版社；2002：418-421.

[7]趙雁林，尚美.我國結核病實驗室診斷的現(xiàn)狀J.中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30（7）：725-728.