李曉華，楊曉潼，翟貴發(fā)，郭 利，王曉麗

(1中南民族大學生命科學學院，生物技術國家民委重點實驗室，武漢430074;2湖北省襄陽市煙草專賣局，襄陽441003)

煙堿(Nicotine)是煙草生物堿中的主要成分，也是影響卷煙品質的重要因素之一［1］.目前，我國烤煙煙堿含量普遍偏高，尤其是上部煙葉，偏高的煙堿含量影響了煙葉質量和煙葉的工業(yè)可用性.故有效降低煙葉中煙堿含量成為煙草行業(yè)急需解決的問題.

目前國內多使用過濾嘴過濾、打孔稀釋和煙草薄片等物理措施來降低煙堿含量，但會造成煙、香、氣的損失.國外煙葉企業(yè)很早就已開始利用微生物發(fā)酵降解煙葉中的煙堿，既可降低煙堿含量又能改進卷煙品質，并滿足消費群體對低煙堿卷煙的需求［2-7］.本研究從長期種植煙草的湖北襄陽土壤中分離煙堿降解菌，研究其降解性能，為微生物在煙草工業(yè)和環(huán)境保護的應用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

土壤采自湖北省襄陽煙葉種植地，Nicotine(純度≥98%)購自洛陽天科生物工程有限公司.煙堿培養(yǎng)基:13.3 g K2HPO4，4.0 g KH2PO4，0.1 g(NH4)2SO4，1.0 g 酵母粉，10.0 mL 微量元素(1.0 g MgSO4·7H2O，0.4 g MnSO4·H2O，0.2 g CaCl2·2H2O，0.2 g CuCl2·2H2O，0.02 gFeSO4·7H2O，用0.1 mol/L HCl溶解到100 mL)，加蒸餾水到1000 mL，自然 pH.培養(yǎng)基121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，加入一定量煙堿(用0.22 μm 濾膜過濾).煙堿分離培養(yǎng)基:在煙堿培養(yǎng)基中添加1.8%瓊脂.種子培養(yǎng)基:10.0 g 胰化蛋白胨，5.0 g 酵母提取物，10.0 g NaCl，溶于900 mL去離子水，用2 mol/L的NaOH調pH值至7.0，用去離子水定容至1000 mL.引物合成和測序由北京三博遠志生物技術有限公司完成.

1.2 煙堿降解菌的篩選

取2.0 g土壤樣品于20 mL煙堿培養(yǎng)基，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng).用0.9%生理鹽水梯度稀釋，涂布于煙堿分離培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)，挑取菌株劃線分離純化.分別將純化的菌株接入煙堿培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，測定發(fā)酵液中煙堿含量.

1.3 煙堿含量的測定

將分離純化的菌株接入煙堿培養(yǎng)基中(煙堿質量濃度為1.0 g/L)，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，以未接菌的煙堿培養(yǎng)基為空白對照.發(fā)酵液于10000 r/min離心10 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀釋至合適的吸光度范圍.以0.05 mol/L HCl溶液為參比，測定發(fā)酵液在259 nm處的吸光值，計算煙堿降解率:煙堿降解率=(原培養(yǎng)液中煙堿含量–發(fā)酵液中煙堿含量)/原培養(yǎng)液中煙堿含量×100%.

1.4 菌種鑒定

參照文獻［8］進行形態(tài)結構觀察和生理生化特性鑒定.參照文獻［9］提取細菌總DNA，測定16S rDNA序列.用于16S rDNA的PCR反應的引物為一對通 用 引 物，正 向 引 物 F1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和反向引物 F2:5'-AAGGAG-GTGATCCAGCC-3'.PCR 反 應 體 系(20μL):10×PCR 緩沖液 2μL，dNTP 1μL，F1 和 F2各1μL，模板 DNA 1μL，Taq 酶 0.25μL，超純水 13.75μL.PCR 反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30 次;最后72℃延伸10 min.用 Blast在GenBank基因庫中對測序結果進行同源性比較和鑒定.1.5 菌體生長量的測定

菌株以5%體積比的接種量接種至煙堿培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，定時取樣測定菌體的生長量和煙堿降解率，以分光光度法OD600表示.

2 結果與分析

2.1 煙堿降解菌的分離

測定分離所得到菌株搖瓶培養(yǎng)24 h后降解煙堿的能力，DAB2菌株煙堿降解結果見圖1.如圖1所示，煙堿培養(yǎng)基(CK)在259nm處有吸收峰，而經搖瓶培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵上清液在259nm處吸收峰消失，表明DAB2菌株具有降解煙堿的能力.

圖1 DAB2菌株發(fā)酵液和煙堿培養(yǎng)基紫外吸收圖譜Fig.1 UV absorption spectrum of fermentation liquid by DAB2 strain and nicotine medium

2.2 DAB2菌株的鑒定

DAB2菌株顯微觀察和生理生化試驗結果為:在煙堿固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色、圓形、光滑凸起、邊緣整齊、不產色素，平板仍是淡黃色;在液體煙堿培養(yǎng)基中，發(fā)酵液顏色從原始澄清透明淡黃色逐漸變成深褐色.革蘭氏染色陰性，伏-普試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗呈陰性，硫化氫試驗呈陽性.

圖2為DAB2菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹可以看出:DAB2菌株與中間蒼白桿菌屬(O.intermedium)分支較近(bootstrap值大于97%).結合生理生化特性，初步確定 DAB2菌株為中間蒼白桿菌(O.intermedium).

圖2 DAB2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain DAB2

2.3 DAB2菌株的煙堿降解特性

DAB2菌株煙堿降解率與生長量的關系結果見圖3.如圖3所示，隨著DAB2菌株的生長煙堿不斷被降解，16 h時DAB2菌株生長量達到最大，此時煙堿的降解率達87.41%，這說明煙堿降解率和菌體生長量呈正相關.

圖3 DAB2菌株的生長與煙堿降解Fig.3 The growth and degradation curve of strain DAB2

DAB2菌株以體積比5%的接種量分別接種到不同質量濃度的煙堿培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，24 h取樣測定菌株生長量和煙堿降解率，結果見表1.當培養(yǎng)基中煙堿質量濃度為1.0 g/L時，煙堿降解率為88.42%，生長旺盛;當培養(yǎng)基中煙堿質量濃度為3.0 g/L時，煙堿降解率為52.46%，生長受到一定程度抑制;當培養(yǎng)基中煙堿濃度高于6.0 g/L時，DAB2菌株生長和煙堿降解均呈下降趨勢，煙堿降解率低于10.36%.

DAB2菌株以體積比5%的接種量接種到煙堿質量濃度為1 g/L的煙堿培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，每隔4 h取發(fā)酵液，在波長為200～400 nm條件進行紫外光掃描，結果見圖4.如圖4所示，0 h時培養(yǎng)基中存在大量煙堿，故259 nm有最大吸收峰，隨著培養(yǎng)時間增加，259nm的特征吸收峰逐漸降低，即煙堿逐漸被DAB2菌株降解.當培養(yǎng)到8 h時，除 259 nm的特征吸收峰外，還在230nm、290nm處出現了2個新峰，推測是DAB2菌株代謝煙堿的中間產物.

表1 不同煙堿質量濃度對DAB2菌株煙堿降解率和生長量的影響Tab.1 Effect of nicotine concentration on growth and degradation of strain DAB2

圖4 DAB2菌株不同時間發(fā)酵液紫外掃描圖譜Fig.4 UV absorption spectrum of nicotine degradation by strain DAB2 at different time

3 結語

本研究從湖北省襄陽煙草種植地中分離得到一株煙堿降解菌，經形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列同源性分析，初步鑒定該菌株為中間蒼白桿菌(O.intermedium).當煙堿質量濃度為1.0 g/L時，煙堿降解率為88.33%，生長旺盛;當煙堿質量濃度達到3.0 g/L時，煙堿降解率為52.46%，生長受到一定程度抑制;當培養(yǎng)基中煙堿濃度高于6.0 g/L時，DAB2菌株生長和煙堿降解均呈下降趨勢，煙堿降解率低于10.36%.煙堿的耐受濃度在無機鹽培養(yǎng)基中可達到6 g/L，比國內早期報道的中間蒼白桿菌DN2［7］耐受能力更高.

在1 g/L煙堿濃度下，DAB2菌株的發(fā)酵上清液紫外掃描圖譜顯示:8 h時259 nm處波峰較4 h降低，并在230 nm和290 nm處出現了新峰，說明中間產物出現，12 h時新峰峰值達到最大，隨后又逐漸降低，直到24 h所有峰值趨平.其降解途徑和中間物還需進一步研究.

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