趙艷梅 楊麗梅 李 倩 陳 寧

(武警后勤學(xué)院防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室，天津 300309)

全身麻醉后大腦發(fā)生基因表達(dá)〔1〕、β淀粉樣沉積〔2〕、神經(jīng)元凋亡〔3，4〕等廣泛而持久的變化，單純的短時間麻醉即可造成實(shí)驗(yàn)動物長時間的認(rèn)知功能障礙〔5～7〕，臨床上稱為術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)，表現(xiàn)為認(rèn)知能力異常、記憶受損、焦慮、人格改變、精神錯亂等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)癡呆，其確切機(jī)制不明。本文探討氯胺酮、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉后對大鼠認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠16只，SPF級，體重180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2007-004。氯胺酮(連云港恒瑞制藥公司，批號KH050201)、咪達(dá)唑侖(江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號20090211)；Y迷宮(張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠)；DY-89 Ⅱ型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit AMV3.0(大連寶生物工程有限公司)；100 bp DNA MarkerⅠ、GoldView核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；瓊脂糖(Sigma)，引物合成由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2大鼠模型制備及分組 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，對照組和麻醉組，每組8只，麻醉組參照文獻(xiàn)〔8〕給予腹腔注射氯胺酮75 mg/kg、咪達(dá)唑侖5 mg/kg進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)。麻醉起效時間以翻正反射消失為標(biāo)準(zhǔn)。以大鼠前爪不能自行翻轉(zhuǎn)為俯臥位，且維持時間≥10 s作為大鼠前爪翻正反射消失的標(biāo)準(zhǔn)。對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3麻醉誘導(dǎo)對大鼠認(rèn)知功能的影響(Y迷宮實(shí)驗(yàn)) 動物適應(yīng)環(huán)境3 d后在安靜的暗室內(nèi)用Y迷宮測定。Y迷宮箱底為銅柵間隔，每臂末端有信號燈，燈亮?xí)r箱底的銅柵無電流，提示為安全區(qū)。每次測試均在同一時間段進(jìn)行，測試時調(diào)節(jié)刺激電壓以保證大鼠在10 s內(nèi)逃避跑動，大鼠受電擊后直接跑到安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。每次大鼠跑至安全區(qū)后持續(xù)光亮30 s，繼而轉(zhuǎn)換燈光進(jìn)行下一次測試，燈光出現(xiàn)的方位按照隨機(jī)次序變換，直至連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)即為達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)。兩組動物麻醉后繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，每日繼續(xù)進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)，于第7天迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動物，觀察麻醉誘導(dǎo)對大鼠認(rèn)知功能的影響。

1.4麻醉誘導(dǎo)對大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體(NR)1、NR2B基因表達(dá)的影響 Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即斷頭處死大鼠，于冰臺上分離雙側(cè)海馬，立即裝入EP管中置于液氮保存?zhèn)溆?。根?jù)NR1(GenBank NM_017010.1)、NR2B(GenBank M91562.1)和β-actin (GenBank NM_031144)cDNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，序列如下：正義鏈：Sense：5′-TCGGTATCAGGAATGCG-3′，反義鏈：5′-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3′；NR2B：正義鏈：5′-GCTCAGCGACCTGTATGG-3′，反義鏈：5′-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3′；β-actin：正義鏈：5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，反義鏈：5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′。PCR反應(yīng)條件如下：循環(huán)條件：94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s；34(β-actin為30)個周期，產(chǎn)物長度：NR1 328 bp，NR2B 381 bp，β-actin 448 bp。RNA提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果，圖像采用Image J分析軟件進(jìn)行處理。以目的基因條帶的綜合光密度與β-actin基因條帶綜合光密度的比值作為目的基因的相對含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠麻醉誘導(dǎo)一般狀況觀察 大鼠在整個麻醉誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，狀態(tài)平穩(wěn)，無豎毛、易激惹、流涎、呼吸急促等現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)動物均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。麻醉起效時間(翻正反射消失時間)為(2.08±0.32) min，<5 min，自然復(fù)蘇時間為(65.12±9.25) min，說明腹腔注射氯胺酮75 mg/kg和咪達(dá)唑侖5 mg/kg可誘導(dǎo)產(chǎn)生可靠的麻醉復(fù)蘇動物模型。

2.2麻醉誘導(dǎo)對大鼠認(rèn)知功能的影響 麻醉組與正常對照組相比，正確反應(yīng)次數(shù)顯著下降(7.88±1.25 vs 9.63±0.52，t=3.787，P=0.002)。提示氯胺酮、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉對大鼠短期(1 w)學(xué)習(xí)記憶能力有一定損害作用。

2.3麻醉誘導(dǎo)對 NR1、NR2B基因表達(dá)的影響 麻醉組與正常對照組相比，大鼠海馬組織內(nèi)NR2B mRNA表達(dá)量顯著降低(66.36±12.33 vs 100±0,t=4.14，P=0.001)，NR1 mRNA表達(dá)量無明顯變化(97.61±9.05 vs 100±0,t=0.89，P=0.67)。說明氯胺酮、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B的mRNA表達(dá)，對海馬內(nèi)NR1的表達(dá)無明顯影響。

3 討 論

NR是海馬參與學(xué)習(xí)記憶功能的一個重要受體。氯胺酮是一種NR的非競爭性拮抗劑，它主要通過作用于NR門控的離子通道中PCP 位點(diǎn)，減少NR通道開放時間和頻率，從而阻斷各種刺激后產(chǎn)生的長時程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)效應(yīng)，干擾學(xué)習(xí)記憶過程〔9〕。王丹等〔10〕給小鼠注射較大劑量的氯胺酮(10～20 mg/kg)后發(fā)現(xiàn)小鼠記憶功能受到損害，并且這種損害作用似呈劑量依賴關(guān)系。劉毓和等〔11〕的研究表明，氯胺酮對老年大鼠認(rèn)知功能有短暫的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)注射麻醉劑量的氯胺酮〔12〕或小劑量氯胺酮〔13〕可對大鼠認(rèn)知功能產(chǎn)生損害，新生1周齡大鼠腹腔注射一次氯胺酮即可出現(xiàn)空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力下降，其機(jī)制可能與NMDA2受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白I 的改變有關(guān)〔14〕。多項(xiàng)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，氯胺酮依賴患者存在明顯的認(rèn)知功能損害〔15，16〕。由此可見，應(yīng)用氯胺酮可能引起大腦學(xué)習(xí)記憶功能的變化，從而導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜劑量的咪達(dá)唑侖可以抑制大鼠的記憶獲得和鞏固并維持較長一段時間〔17〕，大鼠腹腔注射咪達(dá)唑侖可出現(xiàn)東莨菪堿所致的認(rèn)知功能障礙加重的現(xiàn)象〔18〕，因此認(rèn)為咪達(dá)唑侖可能也是導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙的一個重要因素。

海馬是NR的富含區(qū)域，NR 的這幾種亞型在海馬都有表達(dá)，但以NR1、NR2A及NR2B為主。NR與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，其中NR2B與之最為密切〔19〕。本研究說明氯胺酮、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B的mRNA表達(dá)，提示海馬組織內(nèi)NR2B表達(dá)下降可能與認(rèn)知障礙的產(chǎn)生關(guān)系密切，該結(jié)果與以往研究相一致〔20，21〕。

由于學(xué)習(xí)記憶是一個十分復(fù)雜的神經(jīng)活動過程，涉及多個腦區(qū)、多種神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)信號分子和基因表達(dá)等因素，除了谷氨酸遞質(zhì)系統(tǒng)外，還涉及膽堿能系統(tǒng)和其他遞質(zhì)系統(tǒng)，存在多個受體及蛋白分子之間的相互作用，具體氯胺酮和咪達(dá)唑侖如何影響認(rèn)知過程，通過哪些信號分子起作用，尚有待于進(jìn)一步深入研究。

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