田 穎 王 剛

(陜西科技大學(xué)生命與工程學(xué)院，陜西 西安 710000)

環(huán)二肽在多種生物中均有發(fā)現(xiàn)，具有較強(qiáng)的抗癌、抗菌、調(diào)節(jié)激素、調(diào)控能量代謝、調(diào)節(jié)TRH、抗氧化活性及促進(jìn)記憶等功能〔1〕。目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)二肽很多都具有很強(qiáng)的生理活性，例如抗菌、抑制腫瘤等，因此，引起化學(xué)、藥學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。本研究對(duì)脯-甘氨酸環(huán)二肽的免疫活性進(jìn)行多項(xiàng)目研究，擬為新型免疫激活劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 脯-甘氨酸環(huán)二肽(由丹參內(nèi)生菌Bacillusaryabhattai發(fā)酵、純化發(fā)酵液獲得，菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)薛泉宏教授提供)，昆明種健康小鼠，雌性，體重18～21 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1受試物配制 低、中、高劑量環(huán)二肽組純肽加量分別為1.5、2.5、5.0 mg，分別加生理鹽水至10 ml。對(duì)照組不加任何純肽。

1.2.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 將小鼠飼養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為4個(gè)組：高劑量給藥組、中劑量給藥組和低劑量給藥組、對(duì)照組，每組10只。各劑量組灌胃給藥。灌胃量為0.2 ml/10 g。

1.3試驗(yàn)項(xiàng)目及方法〔3〕

1.3.1碳廓清實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1儀器及材料 752分光光度計(jì)、印度墨水,碳酸鈉，瑞氏染粉等。

1.3.1.2試驗(yàn)方法及步驟〔3〕小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按體重隨機(jī)分為：環(huán)二肽試劑高、中、低劑量組及空白對(duì)照組4個(gè)劑量組，每組10 只小鼠；各給藥劑量組每天分別按計(jì)量灌胃1次，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)21 d，期間小鼠自由取水飲食。將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3～4倍。取0.1 g Na2CO3，加蒸餾水至100 ml。在給藥后的第21天，按體重依次給小鼠尾注射墨汁(100 ml/kg)，注入墨汁，同時(shí)計(jì)時(shí)。在2、10 min時(shí),每鼠均由內(nèi)眥靜脈叢采血各20 μl,分別放于2 ml、0.1%Na2CO3溶液中搖勻，待測(cè)。處死小鼠取肝脾稱重。用752分光光度計(jì)，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管光密度值(OD),吞噬指數(shù)。受試物組的吞噬指數(shù)與對(duì)照組比較。

1.3.2抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(PFC)

1.3.2.1材料和儀器 CO2培養(yǎng)箱、補(bǔ)體(豚鼠血清)、SA緩沖液、SRBC、瓊脂糖、0.5%瓊脂糖薄膜玻片；微量血凝實(shí)驗(yàn)板。

1.3.2.2實(shí)驗(yàn)方法 小鼠分組及給藥同碳廓清實(shí)驗(yàn)，連續(xù)灌胃16 d，于給藥后的第16天，用2%SRBC(0.2 ml/鼠)腹腔注射免疫小鼠。免疫后第5天，脫頸椎處死動(dòng)物，取脾臟，補(bǔ)體及脾細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)進(jìn)行溶血空斑測(cè)定。測(cè)定步驟見(jiàn)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》，最后將給藥組的空斑數(shù)與對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.3.3血清溶血素測(cè)定 與PFC實(shí)驗(yàn)共用動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束日摘眼球采血，分離血清，以生理鹽水倍比稀釋，用微量血凝實(shí)驗(yàn)板，加0.5%(V/V)SRBC懸液，進(jìn)行血清溶血素測(cè)定。血清凝聚程度按5級(jí)分法，逐一計(jì)算每鼠血清抗體積數(shù)。

1.3.4NK細(xì)胞活性測(cè)定(LDH)

1.3.4.1儀器和材料 酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)680)、LDH基質(zhì)液、Hank液、靶細(xì)胞(YAC-1)、U型96孔培養(yǎng)板、RPMI1640完全培養(yǎng)液及0.2 mol/LTris-HCl緩沖液等。

1.3.4.2實(shí)驗(yàn)方法 將乳酸鋰(5×10-2mol/L)、硝基化氯氮唑(INT，6.6×10-4mol/L)、吩嗪二甲硫酸鹽(PMS，2.8×10-4mol/L)及氧化型輔酶I均溶于0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，調(diào)pH8.2制成 LDH基質(zhì)液。按衛(wèi)生部《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》〔3〕規(guī)定的方法進(jìn)行靶細(xì)胞(YAC-1)傳代和效應(yīng)細(xì)胞的制備。小鼠分組及給藥灌胃同碳廓清實(shí)驗(yàn)，連續(xù)21 d，期間小鼠自由取水飲食。在給藥后的第21天，處死小鼠無(wú)菌取脾，在Hank液中將其磨碎，再經(jīng)洗滌、離心(1 000 r/min)兩次，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/L，制備成脾細(xì)胞懸液。取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞按程序要求加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中。按要求培養(yǎng)離心。并吸取每孔上清100 μl并加入LDH基質(zhì)液100 μl，同時(shí)置平底U型96孔培養(yǎng)板中，反應(yīng)7 min后每孔加入1 mol/L的HCl 30 μl,在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度值(OD)。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性〔3〕。

2 結(jié) 果

2.1碳廓清實(shí)驗(yàn) 給予不同劑量的脯-甘氨酸環(huán)二肽灌胃21 d后，高、中、低劑量環(huán)二肽組小鼠單核巨噬細(xì)胞碳粒廓清能力(5.331 1±0.965 7、5.634 5±0.595 2、5.127 9±1.226 4)與對(duì)照組(4.239 6±0.904 3)相比均有提高(P=0.038,0.006,0.109)，其中高、中劑量組的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

2.2PFC 高、低劑量組(50.80±12.682、59.70±22.232)產(chǎn)生的溶血空斑數(shù)與對(duì)照組(34.20±9.414)比較差異顯著(P=0.048,P=0.02)。中劑量環(huán)二肽組溶血空斑(48.50±12.232)與對(duì)照組無(wú)差異(P=0.100)。

2.3血清溶血素測(cè)定 高、中、低劑量環(huán)二肽組小鼠產(chǎn)生的抗體積數(shù)(135.40±13.923、130.70±15.173、126.00±18.933)與對(duì)照組(101.30±16.573)比較差異顯著(P均<0.05)，說(shuō)明脯-甘氨酸環(huán)二肽可提高小鼠的特異性體液免疫水平。

2.4NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果 高劑量組的X值(NK轉(zhuǎn)換值)與對(duì)照組差異(39.792±7.683 6、29.962±7.495 9，P=0.019)具顯著差異性，中、低劑量組(26.863±7.901 3、27.737±7.732 9)，與對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P=0.698、P=0.856)。

3 討 論

血液中的外周血單核巨噬細(xì)胞對(duì)異物顆粒的吞噬能力，是評(píng)價(jià)機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，通常用吞噬指數(shù)表示巨噬細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱〔4〕。在本研究碳廓清試驗(yàn)中當(dāng)墨汁被注入小鼠尾靜脈血液中，給藥組的吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組，表明脯-甘氨酸環(huán)二肽能提高小鼠的單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力〔5，6〕。 PFC實(shí)驗(yàn)的原理是將綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠，取小鼠脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，與高濃度綿羊紅細(xì)胞混合后加入瓊脂糖凝膠中，其中每個(gè)釋放溶血性抗體的B淋巴細(xì)胞在補(bǔ)體的參與下可溶解周圍的綿羊紅細(xì)胞，在周圍形成一個(gè)可見(jiàn)的空斑，一個(gè)空斑代表一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑的數(shù)量反映機(jī)體的體液免疫功能。本實(shí)驗(yàn)的各給藥組所產(chǎn)生的空斑數(shù)均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明脯-甘氨酸環(huán)二肽能提高小鼠的體液免疫功能。小鼠血清溶血素值的高低是機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一〔5，6〕,通常用溶血素值表示B細(xì)胞的增殖分化和與補(bǔ)體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力,檢驗(yàn)藥物對(duì)機(jī)體免疫能力影響的重要手段就是測(cè)定溶血素值〔6〕。NK細(xì)胞活性是機(jī)體抗腫瘤、抗感染能力的重要標(biāo)志，本研究NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性。本研究多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示脯-甘氨酸環(huán)二肽能在多方面發(fā)揮免疫促進(jìn)的功能。

4 參考文獻(xiàn)

1Wang DX,Liang MT,Tian GJ,etal.A facile pathway to synthesize diketopiperazine derivatives〔J〕.Tetrahedron Lett,2002;43(5):865-7.

2衛(wèi)生部.保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法〔Z〕.北京:中國(guó)人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部，2003: 119-26.

3鐘建春，張 艷,等.人工冬蟲(chóng)夏草多糖提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版),2011;50(6):100.

4王玉鳳,鳳良元,鄢順琴,等.楮實(shí)子對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008;26(5)：1023-5.

5史 鈞,晏利圣.雞紅細(xì)胞免疫吸附性能與白細(xì)胞數(shù)量關(guān)系〔J〕.生物學(xué)雜志,2005;22(2)：30-1.

6韓玉生,徐 穎,周忠光,等.強(qiáng)脊康對(duì)小鼠體液免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥信息,2007;24(4)：64-5.