王春暉，喬寵，周文平，麻樹仁

（1.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；3.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)鏡中心，沈陽 110016）

KiSS?1基因對人胰腺癌Capan?2細胞的增殖及侵襲的影響

王春暉1，喬寵2，周文平1，麻樹仁3

（1.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；3.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)鏡中心，沈陽 110016）

目的研究KiSS?1基因對人胰腺癌Capan?2細胞增殖、侵襲的影響。方法 經(jīng)脂質(zhì)體介導瞬時轉染上調(diào)Capan?2細胞中KiSS?1基因的表達，采用實時熒光定量PCR和Western blot技術檢測Capan?2細胞中KiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin的表達。采用MTT法分析KiSS?1對Capan?2細胞增殖能力的影響；Matrigel鋪被的transwell侵襲實驗檢測KiSS?1對Capan?2細胞侵襲能力的作用。結果KiSS?1轉染Capan?2細胞36hKiSS?1mRNA開始增多，到48hKiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin表達明顯增強，達到峰值。與空質(zhì)粒轉染組和空白對照組相比，KiSS?1轉染Capan?2細胞48h后，細胞體外侵襲能力顯著下降，侵襲指數(shù)顯著降低（P均<0.01），侵襲力抑制率達到56.5%（P均<0.01），但轉染KiSS?1對Capan?2細胞增殖能力無明顯影響（P均>0.05）。結論KiSS?1是胰腺癌的轉移抑制基因，可作為基因治療的新靶點。

KiSS?1；胰腺癌；增殖；侵襲

胰腺癌是預后最差的消化道惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率逐年上升，目前胰腺癌已占我國腫瘤相關死亡率的第六位。盡管研究者已經(jīng)從多個角度進行胰腺癌的相關研究，但是由于胰腺癌具有局部侵襲力高、早期轉移局部淋巴結等特點，大多數(shù)胰腺癌在獲得診斷時已是局部進展性或發(fā)生轉移，不但使胰腺癌患者在就診時就喪失根治性手術的機會，同時也是根治術后患者死亡的主要原因［1］。因此胰腺癌的轉移機制的研究及抗腫瘤轉移治療成為近年來研究熱點之一。KiSS?1是一種腫瘤轉移抑制基因，其編碼的蛋白肽metastin含有54個氨基酸。本課題組從人類正常胰腺組織中克隆該基因并成功構建了真核表達載體［2］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1及其蛋白肽metastin表達降低與胰腺癌的TNM分期及侵襲和轉移密切相關［3］。提示KiSS?1基因及其蛋白metastin可能在胰腺癌進展過程中起到轉移抑制的作用，但是目前對KiSS?1基因抑制胰腺癌轉移的具體作用機制仍不十分清楚。本研究中以中等轉移活性的人胰腺癌Capan?2細胞系作為研究對象，通過轉染上調(diào)KiSS?1基因及其蛋白的表達，并探討KiSS?1對胰腺癌細胞增殖、侵襲能力的影響，為胰腺癌轉移基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細胞Capan?2細胞系，PcDNA?3/KiSS?1真核表達質(zhì)粒由本室保存；RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清及青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；TRIzol Re?agent、逆轉錄試劑盒、Lipofectamine?2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；SYBRGreen mix購自BIO?RAD公司；BCA蛋白分析試劑盒購自Thermo Fisher公司；兔抗人metastin（1?54）購自Phoenix公司、兔抗人β?actin抗體購自Abcam公司、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；ECL化學發(fā)光試劑盒購自Amersham公司、X?ray膠片、顯影劑、定影劑購自Kodak公司。Transwell小室、Matrigel和FN均購自BD公司；引物序列由大連寶生物公司合成，由Primer 5.0軟件設計。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 細胞培養(yǎng)

Capan?2細胞系使用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基，添加1%的青霉素、鏈霉素，置于37℃、5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72h換液1次，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，按1∶4或1∶5比例傳代，在對數(shù)生長期進行實驗。

1.3 脂質(zhì)體轉染

當細胞融合度達到約90%時，按轉染說明書進行轉染，同時以空質(zhì)粒轉染（空質(zhì)粒轉染組）和不轉染任何質(zhì)粒，僅用脂質(zhì)體處理（空白對照組）的細胞作為對照。細胞以8×105/孔接種在六孔板中，轉染12h后換液，加入含有抗生素的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4 Real?time PCR檢測KiSS?1mRNA的表達

收集轉染前及轉染后24h、36h和48h的上述各組細胞，用TRIzol法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA。應用ABI7300熒光定量PCR儀按SYBRGreen mix說明書進行檢測。預變性95℃3min，變性95℃15s，退火延伸60℃1min，在60℃讀取數(shù)據(jù)；共40個循環(huán)。KiSS?1上游引物為5′?ACT?CACTGGTTTCTTGGCAGCT?3′，下游引物為 5′?CAGAGGCCACCTTTTCTAATGG?3′；內(nèi)參照β?actin上游引物為5′?ACCAACTGGGACGACATGGAGAAAA?3′，下游引物為5′?TACGGCCAGAGGCGTACAGGGATAG?3′。Real?time PCR總反應體系為25μL，其中 cDNA2.5μL（100ng），SYBR?Green Realtime PCRMaster Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL。采用2-△△Ct法分析目的基因mRNA的相對表達量。以上實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測metastin的表達

同上分別收集轉染前及轉染后24h、36h和48h上述各組細胞，取適量RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30min，4℃12000g離心30min，取上清。采用BCA法進行蛋白定量。以50μg蛋白樣品/泳道上樣，15%的SDS?PAGE膠電泳分離，電泳結束后將PAGE膠上的蛋白用Bio?Rad電轉移系統(tǒng)于4℃200mA電轉移60min至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫搖床封閉2h.將然后用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋相應的一抗（兔抗人metastin 1∶500，兔抗人β?actin（1∶1000），將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5min/次，以HRP標記的羊抗兔IgG二抗用封閉液1∶20000稀釋，室溫搖床孵育1h，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。用BIO?RADQuantity One軟件掃描膠片灰度值，以metastin/β?actin的相對表達量進行半定量分析。以上實驗重復3次。

1.6 噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖

在96孔細胞培養(yǎng)板中接種細胞，3×103/孔，每孔體積100μL，設6個復孔，同上轉染并培養(yǎng)24h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，終止培養(yǎng)，去上清，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光值，記錄結果。連續(xù)檢測5d，測得的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.7 Matrigel鋪被的Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力變化

于Transwell小室濾膜內(nèi)表面均勻涂布Matrigel，20μg/孔，外表面涂FN5μg/孔，37℃放置3h，于上下兩個小室加入無血清培養(yǎng)基，并放置于培養(yǎng)箱中水化2h。傾去培養(yǎng)液后在下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入5×104/mL細胞懸液500μL（2.5×104/室），每種細胞做3個小室為平行樣，實驗重復3次。37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)48h后取出，小心用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞，染色，顯微鏡觀察、取10個視野，計數(shù)取平均值。以穿過無Matrigel膜的細胞數(shù)作為對照，計算侵襲指數(shù)和侵襲力抑制率。侵襲指數(shù)=實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)×100%；細胞侵襲力抑制率=（對照組侵襲細胞數(shù)-實驗組侵襲細胞數(shù)）/對照組侵襲細胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 轉染后胰腺癌細胞株中KiSS?1mRNA及其蛋白肽metastin的表達

Real?time PCR結果顯示與轉染前相比，轉染后36h，Capan?2細胞中KiSS?1mRNA表達增加，KiSS?1轉染Capan?2細胞36hKiSS?1mRNA開始增多，達到轉染前的 1.2倍（P<0.01），而到 48hKiSS?1mRNA表達明顯增強，并達到峰值，為轉染前的1.9倍（P<0.01，圖1）。 Western blot顯示轉染前Capan?2細胞中幾乎檢測不到KiSS?1的蛋白肽metastin的表達，轉染后36h，metastin開始增多，到48h metast?in表達明顯增加（圖2）。

2.2 轉染后胰腺癌細胞株Capan?2增殖能力的變化

MTT結果顯示轉染KiSS?1的Capan?2細胞株與空質(zhì)粒轉染組及空白對照組相比，增殖活性未見明顯差異（P>0.05），空質(zhì)粒轉染組及空白對照組相比增殖活性也無明顯差異（P>0.05，圖3）。

2.3 KiSS?1轉染抑制胰腺癌細胞株Capan?2的侵襲能力

結果表明，成功轉染外源性KiSS?1基因的胰腺癌細胞Capan?2穿透Matrigel基底膜的細胞數(shù)顯著低于空質(zhì)粒轉染組及空白對照組細胞（P均<0.01）（圖4），侵襲指數(shù)顯著降低（P均<0.01，圖5），侵襲力抑制率達到56.5%，顯著低于空質(zhì)粒轉染組及空白對照組細胞（P均<0.01，圖6）?？召|(zhì)粒轉染組及空白對照組細胞相比，侵襲穿膜細胞數(shù)無明顯差異（P>0.05）。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)轉移性胰腺癌患者1年生存率低于20%，5年生存率小于5%［4］，高度轉移性是胰腺癌難以緩解并最終死亡的主要原因。近年來胰腺癌的轉移機制的研究及抗腫瘤轉移治療成為研究熱點，目前關于胰腺癌中腫瘤轉移抑制基因的研究尚少。KiSS?1基因為一種腫瘤轉移抑制基因，最初由Lee等在人類惡性黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)［5］，Ohtaki等利用定量PCR研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1mRNA主要表達在胎盤組織中，其次在睪丸、胰腺、肝臟、小腸和腦組織中［6］。本課題組在2005年在國際上首次從人類正常胰腺組織中成功克隆KiSS?1基因，并成功構建了KiSS?1真核表達質(zhì)粒［2］。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)人類胰腺癌組織中KiSS?1mRNA的表達顯著低于正常胰腺組織，其表達與臨床TNM分期、有無轉移和神經(jīng)侵犯密切相關［7］，但與組織學分級無關，表明胰腺癌的轉移與KiSS?1的低表達可能有關，但具體機制不清。

為此，我們選取了幾乎沒有KiSS?1表達的、具有中等轉移活性的胰腺癌細胞株Capan?2作為研究模型，采用轉染的方法使KiSS?1基因過表達，研究KiSS?1基因對胰腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因轉染后，KiSS?1mRNA和metastin的表達明顯增加，胰腺癌細胞Capan?2的增殖能力無明顯改變，表明KiSS?1基因及其蛋白肽metastin對胰腺癌細胞Capan?2的增殖能力無明顯作用［8］。這與KiSS?1基因在黑色素瘤中作用是一致的［5，9］。但還有研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1過表達可抑制胃癌BGC?823細胞的增殖能力。目前認為KiSS?1對于腫瘤細胞的增殖的作用是有細胞特異性的。Masui等在胰腺癌細胞株AsPC?1和PANC?1細胞培養(yǎng)液中添加外源性的metastin，發(fā)現(xiàn)外源性的metastin對于這兩種細胞株的增殖能力無影響［8］，因此可以推測在胰腺癌中KiSS?1及其蛋白肽metastin并不能抑制原發(fā)灶腫瘤細胞的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因轉染后體外培養(yǎng)的胰腺癌細胞Capan?2侵襲能力顯著下降，而空質(zhì)粒轉染及脂質(zhì)體轉染試劑本身對胰腺癌細胞株的侵襲能力無影響，說明KiSS?1基因過表達對于胰腺癌轉移具有明顯的抑制作用。但是Masui等研究發(fā)現(xiàn)了一個奇怪的現(xiàn)象：當外源性給予metastin時，對于胰腺癌細胞株AsPC?1的遷移并不受metastin的影響，而PANC?1細胞的遷移則被1μmol/L和10μmol/L的metastin所抑制，而且這兩種細胞株的侵襲能力并不受metastin的影響［8］。他們認為外源性給予metast?in對于胰腺癌細胞的遷移抑制與其表達的受體GPR54水平有關，且無明顯侵襲抑制效應。

研究發(fā)現(xiàn)KiSS?1基因在不同的腫瘤細胞中發(fā)生的作用及其機制均不同，如在膀胱上皮腫瘤KiSS?1基因通過降低NFkB與MMP?9啟動子的結合，來抑制MMP?9基因的轉錄，進而減少MMP?9的合成，達到抑制腫瘤細胞機動性、趨化性和侵襲性的作用［11］。在胃癌中KiSS?1則通過活化p38MAP激酶來抑制MMP?9的表達，從而抑制胃癌細胞的侵襲［10］。因此我們認為在本研究中KiSS?1過表達對于Capan?2的侵襲能力的抑制，應該是KiSS?1mRNA增加的效應，而不是其蛋白肽metastin增加的效應。在胰腺癌Capan?2細胞中KiSS?1的過表達究竟通過什么方式抑制細胞侵襲的機制和信號傳導通路需要進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性上調(diào)KiSS?1基因的表達可顯著抑制胰腺癌細胞株Capan?2的侵襲，KiSS?1可能成為抗胰腺癌轉移的治療靶點。靶向增加胰腺癌細胞中KiSS?1表達的基因治療可能是治療胰腺癌轉移的新策略。

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（編輯 裘孝琦）

EffectsofKiSS?1onHumanPancreaticCarcinomaCapan?2CellProliferationandInvasion

WANGChun?hui1，QIAOChong2，ZHOUWen?ping1，MAShu?ren3
（1.Department of Hepatobiliary Surgery，General Hospital of Shenyang Millitary Region，Shenyang 110016，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Endoscopy Medical Center，General Hospital of Shenyang Millitary Region，Shenyang 110016，China）

ObjectiveTo investigate the effects ofKiSS?1on the proliferation and invasion abilities of human pancreatic carcinoma Capan?2cells.Metods Transient transfection with Lipofectamine was used to up?regulate the expression ofKiSS?1in Capan?2cells.Tested the expression ofKiSS?1mRNAand Kisspeptin?metastin by real?time quantitative PCRand Western blot.MTTassay was used to detect the influence of KiSS?1on Capan?2cell proliferation.Transwell assay with Matrigel coated was used to evaluate the in vitro invasion ability.ResultsTheKiSS?1mRNAex?pression of Capan?2cells was significantly up?regulated 36hours after transfection.KiSS?1mRNAand metastin reached the peak 48hours after transfection.Comparedwithemptyplasmidtransfectedgroupandblankcontrolgroup，invasionabilityandinvasionindexofCapan?2cellwassignifi?cantly decrease 48hours afterKiSS?1transfection（P<0.01），meanwhile，the inhibition rates of Capan?2cell invasiveness was 56.5%.There were no significant difference of proliferation after transfection compared with empty plasmid group and blank control group（P<0.05）.ConclusionKiSS?1isametastasissuppressorgeneofpancreaticcancer，whichcanbeusedasanoveltargetforgenetherapy.

KiSS?1；pancreatic cancer；proliferation；invasion

R735.9

A

0258-4646（2014）04-0304-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1439.006.html

全軍醫(yī)學科學技術研究“十一五”計劃青年學者課題（06Q014）；遼寧省博士啟動基金（20071038）

王春暉（1972-），男，副主任醫(yī)師，博士.E-mail：wangchh_2013@163.com

2013-12-17

網(wǎng)絡出版時間：2014-04-2914:39