趙唯賢，李宜培，李高申，劉建濤，王保偉，郭梅珍

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451141；2. 黃河科技學(xué)院, 鄭州 450006)

阿爾茨海默病(alzheimer’s diseas,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其起病潛隱，病程呈進(jìn)行性發(fā)展,甚至導(dǎo)致癡呆。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們平均壽命的增加，AD作為當(dāng)今最常見的癡呆類型，逐漸成為威脅人類健康的最重要疾病之一[1]。本研究通過觀察逍遙散干預(yù)后AD大鼠模型海馬相關(guān)指標(biāo)的變化，旨在為未來(lái)AD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

采用清潔級(jí)SD雄性大鼠，鼠齡在4～5個(gè)月，體質(zhì)量(250±20)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批號(hào)SCXX(豫)2010-0002)。

1.2 藥物

逍遙散組成：柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷，各藥間按10∶10∶10∶10∶5∶1∶1比例配比，由我院科研制劑室嚴(yán)格按中藥煎劑制備流程制作。于每日用藥前2 h開始即時(shí)配備，最后濃縮藥液濃度為2 g/mL，備用。奧拉西坦藥粉(奧拉西坦膠囊，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號(hào)05110703)，于每日用藥前30 min用常溫蒸餾水稀釋成濃度為150 mg/mL的奧拉西坦溶液，備用。

1.3 試劑

D-半乳糖(D-gal，Genview公司產(chǎn)品，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司分裝，批號(hào)22L10133)、A-β1～42peptide(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)990901)、PP2A(蛋白磷酸酶-2A)-antibody(abgent，編號(hào) AJ1644a)、GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)、antibody(CST，編號(hào) 9315s)、冷凍包埋劑 McCormick(USA)、TritonX-100 Amresco(USA)。

1.4 儀器

DMS2 型 Morris 水迷宮系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、藍(lán)星 B 型腦立體定位儀2H-(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn))、潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00～18∶00)，室溫22～24℃，濕度30%～40%，喂食普通鼠用顆粒飼料(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，自由飲水。根據(jù)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，留用成績(jī)最優(yōu)者作為正式實(shí)驗(yàn)用大鼠，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理組(A 組)、模型組(B 組)、西藥組(C 組)和中藥組(D組)。

2.2 模型制作

B、C、D 3組采用 D-gal 腹腔注射和 A-β1～42peptide 雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模[2～4]。方法：①自造模第1天始，每天上午9∶00～10∶00按1 mL/100 g劑量，大鼠左下腹腹腔注射D-gal(濃度：10 mg·mL-1)連續(xù)42 d；②D-gal造模結(jié)束，大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛(0.4 mL/100 g)，麻醉后固定在腦立體定位儀，常規(guī)消毒，正中矢狀切開皮膚，確定左右側(cè)海馬位置，牙科鉆開顱暴露硬腦膜，將事前孵育好的A-β生理鹽水溶液(濃度：5μg·μL-1)，用微量注射器在10 min內(nèi)每側(cè)海馬緩慢注入2 μL。A組用等體積滅菌生理鹽水如前進(jìn)行海馬、腹腔注射造模。

2.3 干預(yù)方法

自全部造模結(jié)束后的第4天，每天上午9∶00對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃給藥干預(yù)，每日灌胃1次，連續(xù)干預(yù)治療28 d，灌胃體積均為0.5 mL/100 g。A、B組均采用生理鹽水灌胃， C、D組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。

2.4 標(biāo)本取材

干預(yù)治療完成后第4天，用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭處死取出大腦組織，放在滴有4℃的4%戊二醛固定液的蠟板上(蠟板放在冰盒上)，迅速用刀片從正中剖開大腦，用注射器抽取4℃的4%戊二醛固定液沖洗大腦組織，沖洗固定1～2 min迅速分離海馬，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，分組標(biāo)記并放入裝有4℃的4%戊二醛固定液磨口玻璃瓶中密封，4℃保存待檢。

2.5 石蠟切片制備

將大鼠海馬進(jìn)行修塊、包埋和切片，控制各組中每個(gè)指標(biāo)的切片平面相近。

2.6 免疫組織化學(xué)染色程序(ABC法)

將切片從4℃冰箱中取出室溫放置20 min，在0.5% TritonX-100溶液中37℃孵育10 min。10%的正常羊血清原液封閉(用0.5% TritonX-100 溶液稀釋)室溫輕搖1 h，吸掉封閉血清，加入用5%羊血清和0.5% TritonX-100 混合液稀釋的一抗(PP2A稀釋度為1∶200，GSK-3β稀釋度為1∶150)，室溫孵育3 h。加入生物素標(biāo)記的二抗(用5%羊血清和0.5% TritonX-100 混合液稀釋，稀釋度為1∶500)，室溫孵育1 h；加入配好的ABC反應(yīng)液(1∶100)，室溫孵育2 h。

2.7 圖像處理

選取每批每組冠狀切面相似的切片進(jìn)行照像，圖像在Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，4組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

大鼠海馬CA1區(qū)PP2A和GSK-3β的陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色顆粒，主要表達(dá)于胞漿和細(xì)胞核。圖像及數(shù)據(jù)分析顯示，PP2A在海馬CA1區(qū)的表達(dá)，生理組中PP-2A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，而模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽(yáng)性物面積、MOD、IOD均有明顯下降(P<0.05)；經(jīng)藥物干預(yù)治療后，西藥及中藥組PP-2A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、陽(yáng)性物面積、MOD、IOD較模型組均有明顯增加(P<0.05)(見表1)。生理組中GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，而模型組中GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、陽(yáng)性物面積、MOD、IOD均較生理組有明顯上升(P<0.05)；經(jīng)藥物干預(yù)后，中西藥組GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、陽(yáng)性物面積、MOD、IOD均較模型組明顯下降(P<0.01)(見表2)。

4 討論

GSK-3β屬于蛋白激酶，與神經(jīng)退行性病變有密切聯(lián)系。在AD 的病理形成過程中，它使微管相關(guān)蛋白(Tau 蛋白)磷酸化，Tau 磷酸化后導(dǎo)致微管蛋白不穩(wěn)定，聚集成神經(jīng)纖維纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)元退行性變化[5]。另外，GSK-3β可致使大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)可溶性Aβ前體蛋白(SAPP) 沉積而形成老年斑，而PP-2A在信號(hào)傳導(dǎo)中承擔(dān)著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。有研究認(rèn)為，PP2A 活性降低可能是導(dǎo)致AD腦中Tau蛋白過度磷酸化的原因[4]。在AD模型大腦的病變區(qū)域PP-2A的表達(dá)和活性上調(diào)，能使GSK-3Ser9 去磷酸化，激活GSK-3[6]。在細(xì)胞的凋亡、增生、分化、代謝中起重要作用。

表1 PP2A在海馬CA1區(qū)表達(dá)的變化

注：與生理組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

表2 GSK-3β在海馬CA1區(qū)表達(dá)的變化

注：與生理組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

現(xiàn)在研究多認(rèn)為，AD發(fā)病其基本病機(jī)為五臟虛衰, 特別強(qiáng)調(diào)腎虛精虧的作用[7，8]，似淡化了肝在AD發(fā)病中的作用。實(shí)際上，AD早期常表現(xiàn)為典型的抑郁癥狀和對(duì)日?；顒?dòng)的興趣喪失、記憶力減退、智力下降、意念消極、性格改變等,中醫(yī)臨床常將其歸屬于“呆病”、“郁證”等門類。當(dāng)今社會(huì)中老年人獨(dú)身居住、孤獨(dú)寂寞，加重了情緒壓抑；離異喪偶或子女不孝，更導(dǎo)致精神創(chuàng)傷，這些社會(huì)問題均促成情志的失調(diào)而引起肝的疏泄失常。百病生于氣,氣行則血暢、水濕行、清竅聰、神明清、百病無(wú)由；肝血足則腎精充,髓海得養(yǎng),神魂安藏。因此，“肝氣郁結(jié)”在今日社會(huì)中對(duì)本病的發(fā)病具有重要意義。

逍遙散為疏肝解郁、健脾和營(yíng)的重要方劑，其在精神科應(yīng)用所涉及到的疾病(癥)種類就有13種，包括隱匿性抑郁癥、憂郁癥、癔癥、神經(jīng)官能癥等[9]。有研究顯示，逍遙散可提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,降低潛伏時(shí)間,提高腦組織勻漿超氧化物歧化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、單胺類氧化酶的活性,降低丙二醛含量和乙酰膽堿酯酶活性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C(PKC)在細(xì)胞凋亡中的作用日益突出，PKC活性過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo),導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)失?；虻蛲?。經(jīng)逍遙散治療后應(yīng)激大鼠海馬突觸體PKC活性升高的幅度明顯小于病理對(duì)照組[6]。臨床方面，朱振鐸認(rèn)為七情失調(diào)、情志抑郁不遂是AD的主要病因。而此因素致肝疏泄功能減退、肝郁氣滯，稍受刺激即抑郁難解，久而成呆。因而，以疏肝解郁組方觀察組對(duì)記憶力等綜合積分明顯提高[11]。

本研究提示，經(jīng)逍遙散干預(yù)后PP-2A在大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)中，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增加，陽(yáng)性物面積、MOD、IOD也均有明顯增加(P<0.05)。而GSK-3β經(jīng)逍遙散干預(yù)后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、陽(yáng)性物面積、MOD、IOD下降均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

因此，以疏肝立法從一個(gè)方面提示了對(duì)AD模型某個(gè)環(huán)節(jié)的影響作用。隨著AD發(fā)病率的上升，對(duì)家庭和社會(huì)帶來(lái)的沉重負(fù)擔(dān)也日益凸顯，成為嚴(yán)重的社會(huì)問題，而加強(qiáng)相關(guān)面的研究已成為醫(yī)務(wù)人員乃至政府工作的重要任務(wù)。

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