杜 旭，王瑞輝，王孟林，張曉芹，胥 冰，胡 薇

(陜西中醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046)

周圍神經損傷是指周圍神經干或其分支受到外界直接或間接力量作用而發(fā)生的損傷，屬中醫(yī)“痿證”范疇，臨床上已屬于針灸病譜中神經系統(tǒng)的第三大疾病[1]。顯微外科修復手術、細胞移植等技術，激素、神經生長因子等藥物的應用，均不能使本病的神經功能恢復達到理想狀態(tài)[2]。而大量研究表明，電針療效顯著，能明顯提高本病患者患肢肌力，促進功能恢復，減輕后遺癥[3～7]，其機理尚未完全闡明。周圍神經損傷后的修復再生是一個極其復雜的過程，其關鍵是軸突的再生修復，而損傷的軸突須賴神經生長導向因子的引導，向正確的方向和途徑延伸，才能準確伸入相應靶器官，最終完成再生修復。本文將觀察其中一種導向因子-Slit1在電針治療下的動態(tài)變化，以期為電針治療周圍神經損傷提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

實驗動物采用SD大鼠72只，雌雄各半，每天體質量200±20g，由西安交通大學實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分成正常組、模型組和治療組各24只。

1.2 儀器與試劑

兔抗鼠Slit-1多克隆一抗(Santa Cruz Biotechnology)、SP免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)、RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、G6805- C型電針機(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)。

1.3 模型制作

動物用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。行右后肢背側縱切口，無菌條件下暴露并游離坐骨神經，于梨狀肌下10 mm處將其銳性橫斷，兩斷端用10～0顯微縫合絲線端對端縫合外膜3針，保持吻合口無張力，最后分層縫合肌肉和皮膚。

1.4 處理方法

治療組動物造模后第2天，取“環(huán)跳”(后肢髖關節(jié)后上緣)、“足三里”(膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下約5 mm)，0.19 mm×10 mm針灸針進針0.5 mm后進行電針治療(疏密波，5 Hz，強度以肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度)，每天1次，每次15 min，7 d為1個療程，共治療3個療程；模型組不做治療，但與治療組同樣進行動物抓?。徽＝M不做任何處理。

1.5 標本制備

分別于第1～3療程結束后當天，將各組中8只大鼠用過量水合氯醛經腹腔注射深度麻醉，開胸從左心室插管至升主動脈，先快速灌注生理鹽水約100 ml，隨后灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液300 ml，持續(xù)30 min?？焖偾虚_，暴露坐骨神經損傷區(qū)和相應節(jié)段脊柱區(qū)，嚴格無菌操作下取出坐骨神經(縫合處近、遠端各約1 cm，共約2 cm)和相應節(jié)段脊髓(L4-L6段，約2 cm)組織。

1.6 免疫組化檢測

將所取組織置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液內固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)縱(坐骨神經)、橫(脊髓)切片(片厚5 μm)。采用SP法常規(guī)染色。每組8例，每例檢測3張切片，采用Zeiss ImergerA1顯微鏡和DXM1200F CCD圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，光鏡下Slit1陽性反應物為突出背景的棕黃色顆粒，用圖像分析系統(tǒng) Image-Pro Plus5.1 測定其積分光密度。

1.7 RT-PCR檢測

將所取組織用冰凍生理鹽水沖洗后迅速置于液氮中，后轉至-80 ℃冰箱保存。登錄http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得Slit1全序列，Primer5設計相應特異性引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。slit1上游引物序列：5’- TGTGAAGCACGACTGTGTCA -3’；下游引物序列：5’- TAGCCCTCAGCACAGAGACA -3’，擴增長度312bp。內參β-actin上游引物序列：5’- TCAGGTCATCACTATCGGCAAT -3’；下游引物序列：5’- AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴增長度432bp。首先用Trizol抽提總mRNA，以逆轉錄(RT法)先合成cDNA，然后再進行PCR擴增，反應條件：94 ℃先變性5 min，然后94 ℃30 s，60 ℃45 s，72 ℃40 s，30個循環(huán)，最后72 ℃10 min。RT-PCR產物電泳后用JS-680C全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海培清)分析掃描，經SensiAnsys凝膠圖像分析軟件對每個電泳條帶進行光密度值測定，將測定的光密度值與相應內參光密度值比較，所得比值作為Slit1mRNA相對表達水平的參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 免疫組化檢測結果

模型組與正常組比較，大鼠損傷坐骨神經和相應脊髓段(L4-L6)中Slit1蛋白積分光密度在第1療程后達到高峰之后逐漸降低，但仍高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明坐骨神經損傷后坐骨神經和相應脊髓段中Slit1 蛋白表達增加，高于正常水平。治療組與模型組比較，除第3療程后脊髓相應段中的差異有統(tǒng)計學意義外(P<0.05)，有同樣的趨勢，說明電針治療能明顯增強損傷坐骨神經和相應脊髓段中Slit1蛋白的表達(見表1、圖1、圖2)。

2.2 RT-PCR檢測結果

模型組與空白組比較，大鼠損傷的坐骨神經和相應脊髓段(L4-L6)中Slit1 mRNA /β-actin mRNA光密度比值在第1療程后達到高峰之后逐漸降低，但仍高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明坐骨神經損傷后坐骨神經和相應脊髓段(L4-L6)中Slit1mRNA表達增加，高于正常水平。電針組與模型組比較，有同樣的趨勢，說明治療能明顯增強損傷的坐骨神經中Slit1mRNA的表達(見表2、圖3、圖4)。

表1 各組大鼠各時間點坐骨神經和脊髓(L4-L6)Slit1蛋白積分光密度(IOD)比較

注：與正常組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

表2 各組大鼠各時間點坐骨神經和脊髓(L4-L6)Slit1/β-actin mRNA光密度(OD)比值比較

注：與正常組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★★P<0.01

圖1 各組坐骨神經Slit1蛋白的表達(免疫組化)

圖2 各組脊髓(L4-L6)Slit1蛋白的表達(免疫組化)

圖3 各組坐骨神經Slit1mRNA的表達(RT-PCR)注：A.第1療程結束后；B.第2療程結束后；C.第3療程結束后；1.正常組；2.模型組；3.治療組

圖4 各組脊髓(L4-L6)Slit1mRNA的表達(RT-PCR)注：A.第1療程結束后；B.第2療程結束后；C第3療程結束后；1.正常組；2.模型組；3.治療組

3 討論

自1928年Cajal就提出“神經趨向性”(neurotropism)概念直至上世紀90年代中后期?，F(xiàn)已證實，有4種重要的軸突生長導向分子家族，即Netrins、Slits、Semaphorins和Ephrins[8]，可分為吸引性因子和排斥性因子兩類。它們通過接觸吸引、接觸排斥和化學吸引、化學排斥來調節(jié)軸突靶向生長，最終導致軸突內細胞骨架的重排，實現(xiàn)對生長錐延伸的精確引導，即軸突引導(axon guidance)[9]。Slits為代表性的排斥性因子，分子量170～190 KD，主要由胚胎脊髓聯(lián)合纖維發(fā)育期中樞中線底板處星形膠質細胞分泌[10]。在哺乳動物中，Slit1、Slit2在神經系統(tǒng)中表達廣泛，Slit3則存在于海馬，其受體Roundabou(Robo)在神經元軸突上表達。Slit蛋白具有排斥運動神經元軸突和促進感覺神經纖維分支和延伸的雙重作用，性質取決于其本身和受體[11]。Slit可以和表達于軸突表面即原生質胞膜上的Robo結合，引起一系列信號傳導，最終導致細胞骨架的重排，引導生長錐延伸至正確的方向[12～15]。已有學者認為，Slit對感覺神經元周圍突起的作用比中樞突更為敏感[16]。可見，生長錐的導向就是神經再生和發(fā)育最為關鍵和精細的環(huán)節(jié)之一，高度敏感的生長錐是神經再生的真正前沿。迄今為止，未見PubMed及國內有電針治療周圍神經損傷是否影響Slit表達的論文發(fā)表。

本證屬于中醫(yī)學“痿證/病”范疇，病機主要以氣血不足、營衛(wèi)不調為主，臨床治療以“治痿獨取陽明”為原則。故本實驗選足少陽膽經的“環(huán)跳”和足陽明胃經的“足三里”穴，因為“環(huán)跳”是足少陽膽經與足太陽膀胱經的交會穴，是治療下肢痿痹的要穴；“足三里”是胃經合穴、下合穴，也是治療下肢痿痹、半身不遂等經絡痹阻病癥的要穴，即“治痿獨取陽明”。研究表明，針刺治療坐骨神經痛使用頻次最高的為環(huán)跳，足三里頻次也極高[17]；電針“環(huán)跳”和“委中”能有效減少神經病理性痛大鼠脊髓相應節(jié)段脊髓興奮性氨基酸遞質的釋放，促進抑制性氨基酸遞質的釋放[18]；電針能明顯改善結扎坐骨神經造成慢性壓迫性損傷大鼠的痛敏狀態(tài)，顯著降低損傷側脊髓背角膠質纖維酸性蛋白(GFAP)活性和促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)mRNA的表達[19]。因此，本實驗選取此兩穴配合使用，以疏調經絡之氣、活血止痛，促進周圍神經損傷再生與修復并探究其可能的機制。

本實驗結果表明，SD大鼠坐骨神經切斷即刻外膜端對端縫合后應用電針治療，在3個療程(7 d、14 d、21 d)結束后，損傷的坐骨神經和相應脊髓段(L4-L6)中Slit1 蛋白及其mRNA表達，除第3療程后脊髓相應段中外，其他差異均有統(tǒng)計學意義。說明電針治療可能就是通過增強損傷坐骨神經和相應脊髓段中Slit1蛋白及其mRNA的表達來實現(xiàn)臨床治療作用。但如何影響Slit1蛋白及其mRNA的表達則是一個非常復雜的問題，應與其受體Robo有關，可能還牽涉到其他神經營養(yǎng)因子等影響軸突、神經修復再生的眾多因素及復雜的相互關系，還缺乏全面、綜合的研究。最新研究表明，大鼠坐骨神經橫斷傷(SNT)后Robo1、Robo2mRNA和Robo1在背根神經節(jié)中第3天表達開始增強，高峰在第7天至第14天之間，第21天后回歸低水平，這提示Robo1 通過在SNT后的上調來調節(jié)生長錐遷移，促進軸突生長和神經纖維的延伸[20]。這與本實驗結果基本一致，而電針對Robo1、Robo2mRNA是否有影響就值得進一步探究?？傊?，電針能促進Slit1蛋白及其mRNA的表達，可能是其促進周圍神經損傷修復再生的一個方面，其具體機制則需進一步的研究，最終將為全面揭示電針治療周圍神經損傷提供新的科學依據(jù)。

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