錢 娟，劉 紅（南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，江蘇226001）

·論著與基礎(chǔ)研究·

伴有t（5；12）（q31；p13）的不典型慢性粒細(xì)胞性白血病患者遺傳學(xué)研究*

錢 娟**，劉 紅
（南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，江蘇226001）

目的：研究罕見(jiàn)的不典型慢性粒細(xì)胞性白血病（aCML）患者的遺傳學(xué)和血液學(xué)特征。方法：采用R顯帶法、比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法對(duì)1例不典型慢性粒細(xì)胞性白血病患者進(jìn)行遺傳學(xué)研究。結(jié)果：該患者具有47，xx，+8/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）染色體異常，且具有P53基因突變。入院后給予羥基脲治療，隨訪半個(gè)月后病故。結(jié)論：不典型慢性粒細(xì)胞性白血病惡性程度高，預(yù)后差，遺傳學(xué)研究可確診。

不典型慢性粒細(xì)胞性白血??；p53抑癌基因；R顯帶法；比較基因組雜交技術(shù)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

慢性粒-單核細(xì)胞白血病患者常見(jiàn)t（5；12）（q31；p13）染色體異常，但文獻(xiàn)報(bào)道也可見(jiàn)于不典型慢性粒細(xì)胞性白血病。1998年W lodarska等報(bào)道1例攜帶t（5；12）（q31；P13）染色體異常的aCML患者，且有ETV6基因重排。2008年Falko Fend等證實(shí)aCML是JAK2 V617F陰性的惡性血液腫瘤[1-2]。不典型慢性粒細(xì)胞性白血病具有慢性粒細(xì)胞性白血病的臨床特征，但ph染色體和BCR-ABL融合基因均陰性，預(yù)后差，中位生存僅14～25個(gè)月。近來(lái)我院發(fā)現(xiàn)1例不典型慢性粒細(xì)胞性白血病患者。同時(shí)有+8和t（5；12）（q31；p13），RT-PCR證實(shí)P53基因突變，予以羥基脲治療，未接受任何化療，1個(gè)月內(nèi)死亡。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者女，67歲，因“發(fā)熱伴乏力1個(gè)月”于2011年6月28日收住我院。入院后查體貧血貌，脾臟腫大，肋下5cm，有胸腔積液。血常規(guī)∶WBC79×109/L，血小板55×109/L，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)0.62× 109/L，單核細(xì)胞分類2.2%，嗜堿細(xì)胞分類0.9%，血紅蛋白77g/L。骨髓像檢查原始細(xì)胞12%，擬診慢性粒細(xì)胞性白血?。铀倨冢?。細(xì)胞遺傳學(xué)證實(shí)47，xx，+8[18]/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）[2]，BCR-ABL融合基因陰性，PDGFRA/B、FGFR1陰性。根據(jù)2008年WHO診斷學(xué)標(biāo)準(zhǔn),診斷為不典型慢性粒細(xì)胞性白血病。入院后給予羥基脲治療，患者因?yàn)榧彝ソ?jīng)濟(jì)原因拒絕進(jìn)一步治療，住院1周后自動(dòng)出院，患者隨訪半

個(gè)月后病故。

**[作者簡(jiǎn)介]錢娟，女，漢族，生于1981年2月，江蘇南通人，碩士，研究方向∶白血病的發(fā)病機(jī)制。 通信作者∶劉紅，教授，主任醫(yī)師，E－mail∶liuhong6363@163.com

1.2 方法

1.2.1 染色體檢查∶染色體標(biāo)本取自患者初診時(shí)的骨髓，經(jīng)直接法或24 h短期培養(yǎng)法收獲。染色體標(biāo)本制備和R顯帶按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[3]。有絲分裂指數(shù)（MI）為1 000個(gè)細(xì)胞中的中期分裂相數(shù)量。核型分析根據(jù)《國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名體制（ISCN 1995）》。

1.2.2 aCGH序列分析∶篩選基因組DNA>3μg的樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行酶切。經(jīng)酶切處理的樣品DNA，采用Agilent Genomic DNA Labeling Kit PLUS進(jìn)行標(biāo)記。按照Agilent CGH Human 244K芯片提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒進(jìn)行雜交。芯片結(jié)果用Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565BA，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)設(shè)置Scan resolution=3μm，PMT 100%，得到的掃描圖用Feature Extraction software 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）讀取數(shù)據(jù)并進(jìn)行均一化，用DNA Analytics 6.5.0.58（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 P53基因突變的檢測(cè)∶應(yīng)用DNA抽提試劑盒（invitrogen，CA）按說(shuō)明書步驟抽提細(xì)胞株DNA，PCR擴(kuò)增p53基因。

2 結(jié) 果

2.1 染色體檢查 患者初診時(shí)骨髓細(xì)胞直接法和24 h培養(yǎng)法制備的染色體標(biāo)本R顯帶核型分析結(jié)果提示47，xx，+8。患者白血病細(xì)胞培養(yǎng)7d后所得標(biāo)本染色體的質(zhì)量有明顯改善 ,R帶核型分析示47，xx，+8[18]/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）[2]（圖1）。

圖1 R帶核型分析

2.2 aCGH檢測(cè)結(jié)果 為了證實(shí)該患者的染色體的斷裂位點(diǎn)，采用aCGH分析，證實(shí)染色體的斷裂位點(diǎn)在+8，12p13（圖2）。

圖2 aCGH分析結(jié)果

2.3 P53基因突變的檢測(cè) PCR擴(kuò)增患者初診時(shí)的白血病細(xì)胞的p53基因的第4號(hào)外顯子。擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果顯示4號(hào)外顯子第215位堿基存在點(diǎn)突變，由CCC-CGC，相應(yīng)的氨基酸由脯氨酸變成精氨酸（圖3）。

圖3 P53基因突變的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

本病例初診時(shí)24h培養(yǎng)法所制備的染色體標(biāo)本R顯帶分析顯示47，xx，+8,患者白血病細(xì)胞培養(yǎng)7天后，所得標(biāo)本染色體的質(zhì)量有明顯改善，R帶核型分析示47，xx，+8[18]/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）[2]，表明延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，使分裂相的數(shù)量和質(zhì)量得以改善，從而有助于增加像t（5；12）這樣較為隱匿的異常染色體的檢出機(jī)會(huì)。常規(guī)R顯帶核型分析結(jié)果示NT-1細(xì)胞有與患者原代白血病細(xì)胞株一致的染色體∶47，xx，+8/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）。為了進(jìn)一步證實(shí)染色體的異常，通過(guò)aCGH進(jìn)一步檢測(cè)，NT-1細(xì)胞株具有47，xx，+8及12p13異常核型，但缺乏5q31核型，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)∶AML1/

ETO，BCR/ABL，CBF/MYH11，DEK/CAN，E2A/HLF，E2A/PBX1，EVI1/MDS1/EVI1，MLL/AF1P，MLL/AF4，MLL/AF9，MLL/AF10，MLL/AF17，MLL/AF19，MLL/ AFX，MLL/ELL，MLL/ENL，NPM/ALK，NPM/MLF1，NPM/RARA，PLZF/RARA，PML/RARA，SET/CAN，SIL/TAL1，TEL/ABL，TEL/AML1，TLS/ERG，and TEL/ PDGFR等常見(jiàn)的29種融合基因均陰性，因此該細(xì)胞株建立為新的融合基因克隆奠定了一定的基礎(chǔ)。

P53基因是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。其缺失或突變是實(shí)體瘤常見(jiàn)的異常，但在白血病中較為鮮見(jiàn)[4]。它是重要的抑癌基因，RT-PCR證實(shí)PCR擴(kuò)增p53基因的第4號(hào)外顯子，擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果顯示4號(hào)外顯子第215位堿基存在點(diǎn)突變，由CCC-CGC，相應(yīng)的氨基酸由脯氨酸變成了精氨酸。這可能與該患者發(fā)病后很快死亡有關(guān)。

[1]Fend F，Horn T，Koch I，et al.Atypical chronic myeloid leukemia as defined in the WHO classification is a JAK2 V617F negative neoplasm［J］.Leuk Res，2008，32（12）∶1931-1935.

[2]Yagasaki F，Jinnai I，Yoshida S，et al.Fusion of TEL/ETV6 to a novel ACS2 in myelodysplastic syndrome and acute myelogenous leukemia with t（5；12）（q31；p13）［J］.Genes Chromosomes Cancer，1999，26（3）∶192-202.

[3]薛永權(quán)，過(guò)宇.介紹一種改良的骨髓細(xì)胞染色體熱變性姬姆薩R顯帶法［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1986，9（4）∶247-248.

[4]Imamura J，Miyoshi I，Koeffler HP.P53 in hematologic maligancies［J］.Blood，1994，84（8）∶2412-2421.

Cytogenetic analysis on atypical chronicm yeloid leukem ia patientw ith t(5;12)(q31;P13)

QIAN Juan,LIU Hong
(Departmentof Hematology,Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

Objective:Cytogenetic analysiswas conducted on a rare atypical chronic myeloid leukemia(aCML)patient.M ethods:Various methods were applied to identify and characterize aCML patient’s cytogenetics,including R-banding technique,aCGH,RT-PCR.Results:Cytogenetic analysis demonstrated two abnormalities:47,xx,+8 and 47,xx, +8 accompanied by t(5;12)(q31;p13)translocation,and P53 genemutation.Conclusion:Cytogenetic analysis is a powerful tool in diagnosing aCML.

atypical chronic myeloid leukemia;p53;R-banding technique;comparativegenomichybridization （CGH）;reverse transcriptate polymerase chair reaction(RT-PCR)

R733.73

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81070400）；江蘇省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（LJ201136）。

2014-08-30

1006-2440（2014）05-0430-03