劉郁鵬，朱燁菁，陳 櫞，錢 俊，黃向華，周曉梅，劉玉山，張一心，施民新，毛清華（南通市腫瘤醫(yī)院外科，江蘇66；南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院；南通市腫瘤醫(yī)院病理科）

新輔助化療對(duì)相關(guān)肺癌基因Bcl-2和Beclin-1表達(dá)影響

劉郁鵬1*，朱燁菁2，陳 櫞1，錢 俊2，黃向華1，周曉梅1，劉玉山3，張一心1，施民新1，毛清華1
（1南通市腫瘤醫(yī)院外科，江蘇226361；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3南通市腫瘤醫(yī)院病理科）

目的：探討Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌（lung adenocarcinoma）患者體內(nèi)Bcl-2和Beclin-1基因、蛋白表達(dá)與新輔助化療間關(guān)系。方法：經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌80例患者組織中Bcl-2和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)治療后Ⅱ～Ⅲ期肺腺癌患者組織中Bcl-2和Beclin-1基因表達(dá)水平，并研究2種基因表達(dá)與新輔助化療療效間關(guān)系。結(jié)果：治療前兩組之間Bcl-2和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Beclin 1與Bcl-2在肺腺癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.43，P<0.01）。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)新輔助化療后，化療組Beclin-1mRNA水平明顯高于對(duì)照組，而Bcl-2水平明顯低于對(duì)照組，治療前恰恰相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：利用新輔助順鉑和多西他賽方案術(shù)前化療，可影響肺腺癌組織中Bcl-2和Beclin-1的表達(dá)水平，為研究抑制Bcl-2的表達(dá)提高臨床參考。

肺腺癌；新輔助化療；Bcl-2；Beclin-1；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學(xué)法

1 資料與方法

1.1 一般資料 收治II-IIIA期肺腺癌患者80例分為兩組，（1）化療組∶接受新輔助化療且成功手術(shù)切除患者40例，年齡47～75歲，平均62.9歲，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的肺腺癌。（2）對(duì)照組∶為同期住院直接手術(shù)切除肺腺癌患者40例，患者在術(shù)前均未經(jīng)任何放化療和免疫治療。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。入選標(biāo)準(zhǔn)∶（1）術(shù)前CT引導(dǎo)下經(jīng)穿刺空芯針活檢，經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)為肺腺癌；（2）術(shù)前未接受任何其他抗腫瘤治療；（3）術(shù)前評(píng)估∶對(duì)可切除的II～I(xiàn)II期肺腺癌患者且無化療禁忌證，其中術(shù)前新輔助化療方案選用DP方案“順鉑（40mg/m2d1，2，3）和多西他賽（120mg/m2d1）的化療方案”進(jìn)行2個(gè)周期術(shù)前新輔助化療。手術(shù)在化療結(jié)束后4周進(jìn)行，按照NCCN指南行術(shù)前輔助性化療。治療前均經(jīng)患者和家屬充分知情同意，并簽署化療知情同意書。（4）根治性手術(shù)切除即腫瘤所在肺葉切除；（5）術(shù)后病理確診為肺腺癌及pTNM分期。所有入組患者未合并其他惡性腫瘤及嚴(yán)重內(nèi)科疾病，從未接受過放化療及手術(shù)治療，一般狀況良好。均收集患者術(shù)前活檢蠟塊及手術(shù)切除的新鮮冰凍組織。

表1 術(shù)前化療組和對(duì)照組患者不同臨床參數(shù)關(guān)系

1.2 材料和試劑 兔抗人Bcl-2和Beclin-1多克隆抗體和內(nèi)參β-actin（Millipore），工作液按1∶300稀釋。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（Dako Cytomation，USA）。real-time PCR試劑盒∶High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler?（Roche公司）。TRIzolReagent（Invitrogen公司）。DAB顯色試劑盒由我院病理科提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 按照PCR引物設(shè)計(jì)原則并利用Primer Primiers 5軟件和在線Oligo Calculator工具設(shè)計(jì)Beclin-1，Bcl-2，β-actin引物序列（表2），引物交由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

表2 Beclin-1，Bcl-2，β-actin引物序列

1.4 免疫組織化學(xué)法 活檢組織經(jīng)常規(guī)HE染色確診，組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2，室溫孵育10分鐘，水洗4分鐘×4次。采用高壓鍋水浴法熱修復(fù)的方法進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS緩沖液洗4分鐘×4次。分別滴加兔抗人Bcl-2和Beclin-1多克隆一抗工作液，于4℃冰箱孵育過夜。從冰箱中取出切片后用PBS緩沖液洗4分鐘×4次，滴加羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30分鐘。切片取出后用PBS緩沖液洗4分鐘×4次，DAB顯色劑顯色3min，蘇木素復(fù)染。以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。Bcl-2和Beclin-1用經(jīng)過3次重復(fù)檢測(cè)均為

陽性的病例作為陽性對(duì)照。免疫組化切片在光鏡× 400下進(jìn)行圖像分析（IPWIN60圖像熒光分析軟件），每張切片觀察5個(gè)高倍視野，分別測(cè)量細(xì)胞質(zhì)中Bcl-2、Beclin-1表達(dá)的平均光密度值。

1.5 realtime-PCR方法 術(shù)后冰凍組織標(biāo)本，每份凍存標(biāo)本取1mm3剪碎研磨，加入1mL Trizol溶液裂解，按Trizol試劑盒說明書采用一步法提取總RNA。realtime-PCR檢測(cè)方法參照Roche說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組Beclin 1和Bcl-2在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。比較治療后兩組間Bcl-2和Beclin-1表達(dá)差異，組間分析采用Fisher’s exact test檢驗(yàn)，組內(nèi)分析采用 nonparametric Wilcoxon matched-pairs test。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中收集所有肺癌組織均經(jīng)過HE染色證實(shí)其為肺腺癌。術(shù)前活檢組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，結(jié)果顯示Bcl-2和Beclin-1在癌組織中表達(dá)呈深褐色染色，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖1）。術(shù)前活檢Bcl-2和Beclin-1蛋白表達(dá)與分組的關(guān)系差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

圖1 a 肺腺癌中Bcl-2蛋白的表達(dá)情況（400×）

圖1 b 肺腺癌中Beclin-1蛋白的表達(dá)情況（400×）

表3 術(shù)前活檢Beclin 1和Bcl-2在肺癌組織中的表達(dá)情況

2.2 Beclin 1與Bcl-2在人肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Beclin 1與Bcl-2蛋白在人肺癌組織中表達(dá)的平均光密度值散點(diǎn)圖顯示，并經(jīng)Pearson相關(guān)性分析兩者呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.43，P<0.001）（圖2）。

圖2 Beclin-1、Bcl-2的平均光密度值散點(diǎn)圖

2.3 Realtime-PCR結(jié)果 Bcl-2和Beclin-1 mRNA表達(dá)水平化療組比對(duì)照組明顯增高（圖3）。（1）對(duì)照組Bcl-2（3.692±0.1549）與化療組Bcl-2（4.262± 0.1859），經(jīng)治療后Bcl-2明顯升高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）對(duì)照組Beclin-1（2.815± 0.1283）與化療組Beclin-1（5.345±0.1399），經(jīng)治療后Beclin-1明顯升高（圖4），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖3 Bcl-2和Beclin-1mRNA癌中表達(dá)水平

3 討 論

隨著臨床研究不斷深入，新輔助化療聯(lián)合手術(shù)成為治療局部晚期肺癌的新方法。術(shù)前予以化療可使腫瘤細(xì)胞活力降低，腫瘤縮小，有利于腫瘤切除。但化療有時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的獲得性耐藥，以及腫瘤細(xì)胞的凋亡缺陷或受阻常是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵因素。如何提高治療效果，防止耐藥株的產(chǎn)生成為治療的關(guān)鍵。如何在治療前基因水平預(yù)判術(shù)后療效及預(yù)后成為選擇治療方法的關(guān)鍵。

Beclin-l基因是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物唯一自噬基因。主要作用是調(diào)節(jié)自噬水平參與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)及再利用受損細(xì)胞器的清除，并維護(hù)細(xì)

胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Beclin-1的下調(diào)能導(dǎo)致自噬、凋亡的缺陷、細(xì)胞惡性度增加、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。Bcl-2家族是與凋亡有關(guān)的基因家族，包括不同功能的癌基因，Bcl-2、Bcl-xL在許多腫瘤中表達(dá)較高，其下調(diào)促進(jìn)自噬發(fā)生。而Bcl-2基因是凋亡調(diào)節(jié)基因家族中的代表，其過度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。文獻(xiàn)報(bào)道，Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥，而體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制Bcl-2基因表達(dá)可有效提高NSCLC對(duì)順鉑的敏感性[4]。

Swerdlow等[5]發(fā)現(xiàn)，Bcl-2下調(diào)Beclin-1依賴的自噬及Beclin-1依賴的自噬性細(xì)胞死亡，此發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了Bcl-2家族成員通過抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻斷自噬來發(fā)揮原癌基因的作用。同時(shí)，Bcl-2家族其他成員也參與自噬的調(diào)控。Bcl-2家族通過與Beclin-l總蛋白的BH3結(jié)合域結(jié)合，達(dá)到抑制自噬的作用。文獻(xiàn)認(rèn)為二者在功能上存在聯(lián)系，即自噬為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡。自噬抑制凋亡，保護(hù)細(xì)胞避免發(fā)生凋亡和壞死；自噬向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。但自噬與凋亡間相互轉(zhuǎn)換具體機(jī)制還不完全明了。目前凋亡機(jī)制已研究甚廣，而對(duì)自噬性細(xì)胞死亡的作用機(jī)制還在研究。據(jù)報(bào)道40%～75%的人類偶發(fā)性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞中Beclin-1存在單等位基因缺失。Beclin-1等位基因敲除的小鼠自發(fā)性惡變幾率增加[6]。鄭海燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1蛋白表達(dá)缺失利于肺部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，隨著腫瘤的進(jìn)展和分化程度的降低，Beclin-l的陽性表達(dá)率逐漸下降。而作為凋亡抑制基因的Bcl-2基因，在肺癌及癌前病變組織中的表達(dá)高于在正常肺組織中的表達(dá)。Bcl-2在Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)高于Ⅰ+Ⅱ期，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌。Beclin-1與抗凋亡基因Bcl-2在原發(fā)性肺癌中的陽性表達(dá)率密切相關(guān)。Bcl-2和Beclin-1共同參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，在人體內(nèi)Bcl-2與Beclin-1之間的關(guān)系與化療間聯(lián)系尚報(bào)道不多。

以鉑類為主的化療藥是用于肺癌的一線化療藥物，但其腫瘤耐藥性一直是臨床治療難以克服的障礙，有研究表明[8]DDP等藥物可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，說明自噬可能與腫瘤耐藥性存在一定的關(guān)系。本文研究了新輔助DP方案治療后腫瘤組織中Beclin-1與Bcl-2基因分子水平的變化，發(fā)現(xiàn)Bcl-2經(jīng)治療后略微下降，而Beclin-1升高更明顯。說明經(jīng)化療后腫瘤自噬增加，導(dǎo)致了腫瘤間部分細(xì)胞的自噬性死亡。而Bcl-2經(jīng)化療后表達(dá)水平略微下降，術(shù)后病理提示部分腫瘤細(xì)胞仍然具有活性，部分患者體內(nèi)的Bcl-2仍發(fā)揮著抗凋亡作用，說明化療后Bcl-2高表達(dá)有可能是導(dǎo)致治療失敗的可能因素之一。也有可能化療后的腫瘤細(xì)胞Beclin-1的增高，導(dǎo)致自噬作用增強(qiáng)，通過自噬作用清除掉受損腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，使其部分長(zhǎng)期生存。而Bcl-2的增多抑制了細(xì)胞凋亡，使得細(xì)胞凋亡不足，導(dǎo)致本應(yīng)通過凋亡死亡的細(xì)胞不能發(fā)生凋亡。從而引起腫瘤細(xì)胞的異常增多，最終導(dǎo)致腫瘤化療后仍具有活性。

有研究[9]表明沉默Beclin-1基因表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖信號(hào)傳導(dǎo)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，使細(xì)胞增殖能力下降，提高A549/DDP細(xì)胞的化療敏感性，抑制細(xì)胞的增殖能力。本文采用realtime PCR技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)水平，觀察其表達(dá)差異。探討其在腫瘤化療前后差異，觀察其表達(dá)水平，有助于幫助選擇手術(shù)后輔助化療適用對(duì)象和優(yōu)化治療方案，提高治療療效。為針對(duì)同一家族的Beclin-1和Bcl-2作為聯(lián)合基因治療靶點(diǎn)提供參考，從而提高治療療效。新輔助化療能降低腫瘤分期，增加手術(shù)切除率，從而提高患者的生存質(zhì)量甚至生存率，但腫瘤細(xì)胞的抗藥性導(dǎo)致新輔助化療療效存在較大差異。本研究應(yīng)用realtime PCR法檢測(cè)患者癌組織中的原癌基因Bcl-2和自噬基因Beclin-1表達(dá)水平，結(jié)合新輔助化療的療效進(jìn)行分析，旨在尋找肺癌的化療耐藥因子，判斷患者預(yù)后可能存在的敏感性指標(biāo)，制定出更有效的個(gè)體治療方案。

目前，新輔助化療是肺腺癌有效的綜合治療手段之一，對(duì)于Bcl-2高表達(dá)和Beclin-1低表達(dá)的患者，選擇何種化療方案進(jìn)行新輔助化療值得進(jìn)一步研究。選擇合適化療方案能夠延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，Bcl-2明顯升高患者，術(shù)后輔助化療可選擇非鉑的化療方案，以提高治療療效。檢測(cè)新輔助化療對(duì)Bcl-2和Beclin-1表達(dá)的影響，有助于探討新輔助化療對(duì)腫瘤耐藥性的影響和指導(dǎo)肺腺癌的個(gè)體化治療，這將成為本課題組今后的研究重點(diǎn)。

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The effect of neoadjuvant chemotherapy on the expression of lung cancer related genes Bcl-2 and Beclin-1 in lung adenocarcinoma

LIU Yupeng1,ZHU Yejing2,CHEN Yuan1,QIAN Jun2,HUANG Xianghua1,ZHOU Xiaomei1,
LIU Yushan3,ZHANG Yixin1,SHIMinxin1,MAO Qinghua1
（1Department of Surgery,Nantong Tumor Hospital,Jiangsu 226001；2Medical School of Nantong University；3Departmentof Pathology,Nantong Tumour Hospital）

Objective:To investigate the expressions of Bcl-2 gene and Beclin-1 gene and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy in patientswith stage II-III lung adenocarcinoma.M ethods:Eighty patientswith stageⅡ-Ⅲlung adenocarcinomawere randomly divided into two groups and were enrolled in the study before chemotherapy:one group accepted operation treatment after two weeks of neoadjuvant chemotherapy;the another directly accepted operation treatment.The expression of Bcl-2 and Beclin-1 were detected bv immunohistochemistry before chemotherapy and the correlation of the expression of Bcl-2 and Beclin-1 the response rate of chemotherapy was analyzed.ThemRNA expression of Bcl-2 and Beclin-1 weremeasuerd by realtime-PCR after neoadjuvant chemotherapy.The relationship between the two groups and the change of the gene expression levels under the impact of neoadjuvant chemotherapy was studied.Result:There was no difference in Bcl-2 and Beclin-1 protein expression between the groups before chemotherapy,and was negatively correlated between Beclin 1 and Bcl-2 expression levels in lung adenocarcinoma（r=-0.43,P<0.001）.Itwas showed that Bcl-2 and Beclin-1mRNA levelswere significantly differentafter neoadjuvant chemotherapy by realtime PCR.The results showed that themRNA levels of Beclin-1 expression were significantly higher in chemotheroapy group than control group while the expression of Bcl-2 decreased.The gene expression levelswere the significant difference between the two groups（P<0.05）.Conclusion:The data indicated that neoadjuvant chemotherapymight influence the expressions of Bcl-2 and Beclin-1 in lung adenocarcinoma and provide clinical reference for the inhibition of Bcl-2 expression.

lung adenocarcinoma；neoadjuvant chemotherapy；Bcl-2；Beclin-1；real time polymerase chain reaction; immunohistochemistry

R734.2

A

劉郁鵬，男，漢族，江蘇南通人，生于1981年7月，碩士，主治醫(yī)師。研究方向∶主胸部腫瘤外科的診斷與綜合治療。 通信作者∶毛清華，E-mail∶mqhchf69@sina.com

2014-09-14

1006-2440（2014）05-0449-05

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。2010年衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2005年肺癌死亡率占我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第1位?，F(xiàn)在治療手段有限，且治療效果

和預(yù)后均不理想。臨床I、II期患者經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的外科治療后，5年生存率達(dá)40%，而局部晚期患者據(jù)病變的范圍和是否可切除，其5年生存率為5%～35%。肺腺癌屬于NSCLC一種，常常好發(fā)于肺周圍，起病隱秘，早期無征兆，通常診斷出來時(shí)已經(jīng)是晚期，易發(fā)生胸壁轉(zhuǎn)移。其中癌基因Bcl-2在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤組織中過表達(dá)，并不同程度地抑制化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高NSCLC對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶等化療藥物對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的殺傷能力[2]。因此抗凋亡癌基因Bcl-2和抑癌基因Beclin-1，在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡及提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性方面發(fā)揮著重要作用[3]。目前，術(shù)前采用新輔助化療的治療方法越來越受到重視。本研究回顧性調(diào)查我院2008年1月—2013年12月收治的II～I(xiàn)IIA期肺腺癌患者，以Bcl-2和Beclin-1水平為指標(biāo)分析單純手術(shù)治療和術(shù)前配合新輔助化療的臨床療效，為療效判斷及預(yù)后評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。