秦寧寧(綜述)，王秋月(審校)

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110001)

糖尿病的發(fā)病率逐年升高，成為當(dāng)今社會(huì)多發(fā)病、慢性病之一，其并發(fā)癥嚴(yán)重困擾著人們的生活。作為模式識(shí)別受體之一的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)具有激活抗原呈遞細(xì)胞的潛在免疫調(diào)節(jié)能力，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎性因子并激活炎性反應(yīng)細(xì)胞到達(dá)病灶而殺死病原體[1]。其中，TLR4在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)及其并發(fā)癥，特別是微血管并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用。

1 TLR4的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1TLR4結(jié)構(gòu)及分布 1997年Medzhitov等[2]首次發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其編碼的TLR蛋白，即如今的TLR4蛋白。其基因位于第9號(hào)染色體，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Toll相關(guān)蛋白，屬于Ⅰ型跨膜受體。TLR胞外區(qū)由18～31個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列組成，其中TLR4具有24個(gè)亮氨酸重復(fù)序列；胞內(nèi)區(qū)含有大約200個(gè)氨基酸殘基，由Toll同源結(jié)構(gòu)域和分子C端長(zhǎng)短不同的短尾肽(0～22個(gè)氨基酸)組成[3]。TLR4分布于許多免疫和非免疫細(xì)胞，如外周血白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B/T淋巴細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞等。

TLRs家族成員種類繁多，已發(fā)現(xiàn)的TLRs蛋白包括人類的11種及鼠類的13種。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs家族在體內(nèi)慢性炎性反應(yīng)中起著重要作用[4]。TLRs主要在參與免疫反應(yīng)的組織和細(xì)胞中表達(dá)，其分布也提示TLRs是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體。TLR4是研究最早、作用最為明確的TLR分子，能識(shí)別多種配體，如脂多糖、熱激蛋白70、熱激蛋白60及高速泳動(dòng)族B1蛋白(high-mobility group box protein-1，HMGB1)等，識(shí)別的病原菌主要是革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。促炎細(xì)胞因子的合成與釋放是TLRs分子最突出的生物學(xué)活性。TLR4配體通過與其受體結(jié)合，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，分泌釋放白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1、IL-6、IL-12、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干擾素γ等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)殺菌及吞噬活性，同時(shí)也在炎性反應(yīng)中起重要作用[5-6]。

1.2TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 TLR4為TLRs家族最受關(guān)注的成員之一，可介導(dǎo)多種信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性因子的釋放及體內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生。但是其介導(dǎo)的信號(hào)通路復(fù)雜且存在很多爭(zhēng)議，目前研究表明，TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有兩條：髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)依賴性及非依賴性途徑[7]。

MyD88是TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要接頭蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為3.5×104，含有三個(gè)功能域，包括N端的死亡域、中間的連接域和C端的Toll/IL-1受體域。利用MyD88基因剔除小鼠研究TLR4的兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)現(xiàn)，MyD88對(duì)早期脂多糖反應(yīng)具有重要作用[8]。革蘭陰性菌釋放的脂多糖在血流中與血清因子脂多糖結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，然后與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的膜性CD14相互作用。內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞缺乏CD14，但是可以利用可溶性的CD14促進(jìn)與脂多糖的結(jié)合，脂多糖、脂多糖結(jié)合蛋白和CD14三者相互作用激活TLR4信號(hào)途徑。MyD88依賴途徑包含許多信號(hào)分子：接頭蛋白MyD88、IL-1受體相關(guān)激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase-1，TAK1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-活化激酶結(jié)合蛋白(transforming growth factor-β-activated kinase binding protein，TAB)1、TAB2和TNF受體相關(guān)因子6。IL-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)是IL-1受體和TLR絲氨酸/蘇氨酸激酶，激活NF-κB，有四個(gè)IRAK參與TLR信號(hào)，分別為IRAK1，IRAK2，IRAK4和IRAK-M。TLR一旦被病原相關(guān)分子模式刺激，MyD88作為接連蛋白就被招募到TLR，與其Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合；MyD88進(jìn)一步招募IRAK4形成TLR-MyD88-IRAK4信號(hào)復(fù)合物，然后再招募IRAK1，接著磷酸化使其激活；激活的IRAK1，其N端殘基發(fā)生自身磷酸化，從而導(dǎo)致TNF受體相關(guān)因子6的招募，并結(jié)合到信號(hào)復(fù)合物的受體上；然后，IRAK1-TNF受體相關(guān)因子6復(fù)合物從受體分離，與另一種由TAK1、TAB1和TAB2組成的復(fù)合物相互作用，TAK1發(fā)生磷酸化并被激活，使核因子κB抑制蛋白激酶磷酸化，導(dǎo)致NF-κB激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8和TNF等促炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)和放大吞噬細(xì)胞的殺菌作用[9]。

MyD88非依賴性的信號(hào)途徑又稱干擾素βToll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白依賴途徑[10]，β干擾素Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白與TNF受體相關(guān)因子家族成員相關(guān)的NF-κB激活劑結(jié)合激酶1、核因子κB抑制蛋白激酶以及干擾素調(diào)節(jié)因子3結(jié)合，使核因子κB抑制蛋白激酶發(fā)生磷酸化并激活干擾素調(diào)節(jié)因子3，從而使其相應(yīng)的因子轉(zhuǎn)錄，主要觸發(fā)誘導(dǎo)干擾素β[11]。

2 TLR4在T2DM中的表達(dá)

隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變，近年來糖尿病的發(fā)病率持續(xù)升高。糖尿病是一種炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為循環(huán)及細(xì)胞生物標(biāo)志物的增加，如血漿C-反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子(IL-1、TNF、IL-6)、趨化因子和纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑1[12]。有研究表明，在糖尿病患者的外周血單核細(xì)胞中存在TLR4的表達(dá)升高，且與炎性反應(yīng)相關(guān)[13]，T2DM患者存在代謝紊亂、氧化應(yīng)激增強(qiáng)等，可使TLR4內(nèi)源性配體非脂化脂肪酸、氧化型低密度脂蛋白、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、熱激蛋白70等增多。T2DM患者肌肉和單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)增加，并與血漿炎性反應(yīng)因子水平呈正相關(guān)[14]。TLR4及其配體表達(dá)增多，激活TLR4信號(hào)通路，參與炎性反應(yīng)[15]。

T2DM患者本身的細(xì)胞功能異常也可以增強(qiáng)TLR4信號(hào)通路的作用，高糖可以增加細(xì)胞對(duì)脂多糖的敏感性。高糖作用的細(xì)胞受脂多糖作用后，炎性反應(yīng)因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)明顯增強(qiáng)[16-17]。高糖的刺激作用可使細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，NF-κB活化和促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而增強(qiáng)TLR4信號(hào)通路，參與炎性反應(yīng)[18]。

3 TLR4與T2DM微血管并發(fā)癥

微血管一般指微小動(dòng)脈和微小靜脈之間的毛細(xì)血管及微血管網(wǎng)。糖尿病微血管病變主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜、腎、神經(jīng)組織及皮膚等，其中以糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)和視網(wǎng)膜病變最為重要。T2DM患者中性粒細(xì)胞受脂多糖作用后較正常人產(chǎn)生更多的炎性反應(yīng)因子，T2DM鼠巨噬細(xì)胞受脂多糖刺激后，炎性反應(yīng)因子分泌較對(duì)照鼠增多，表明T2DM中TLR4信號(hào)通路作用增強(qiáng)，TLR4配體與其受體結(jié)合，通過MyD88依賴性和非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子和干擾素的表達(dá)，參與對(duì)炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生[19]。TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的大小和持續(xù)時(shí)間，由TLR4配體的有效性、TLR4的數(shù)量及TLR4負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白所決定。外源性及內(nèi)源性配體可增加TLR4的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。有研究表明，TLR4依賴反應(yīng)有助于新生血管的HMGB1在缺血性神經(jīng)組織的釋放，這確認(rèn)了TLR4對(duì)缺血性神經(jīng)組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，有助于新生血管的形成，表明TLR4在T2DM微血管并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用[20]。

3.1糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見、最主要的微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為當(dāng)前全球致盲的重要原因，其發(fā)生與病程相關(guān)，糖尿病病程超過10年，大部分患者合并程度不等的視網(wǎng)膜病變。其發(fā)病機(jī)制認(rèn)為是由于視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)受損所致。HMGB1是細(xì)胞核內(nèi)除組蛋白外的染色質(zhì)蛋白，是一種多功能蛋白，參與調(diào)控基因表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和血管生成、誘導(dǎo)炎癥發(fā)生、激發(fā)免疫反應(yīng)等，是TLR4內(nèi)源性配體之一，由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌[21]。HMGB1的信號(hào)主要有3個(gè)受體，包括高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體、TLR2和TLR4[22]。

有研究表明，鼠角膜和培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9，角膜炎癥主要依賴于TLR4信號(hào)，因?yàn)檠装Y是一個(gè)重要過程，鏈接血管的生成[23]。Park等[24]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外的HMGB1可以在脂多糖、TNF-α或IL-1的刺激下由單核細(xì)胞主動(dòng)分泌，還可以通過與其受體TLR4結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和黏附因子，以致誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成，破壞血-視網(wǎng)膜屏障。

3.2DN DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，常見于病史超過5年的患者，臨床特征為蛋白尿，漸進(jìn)性腎功能損害、高血壓、水腫，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前認(rèn)為DN受多方面因素影響，包括遺傳因素、血流動(dòng)力學(xué)異常以及高糖相關(guān)的生化代謝異常等[25-26]。在DN患者腎組織中發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，并與蛋白尿、腎功能狀態(tài)密切相關(guān)，這對(duì)理解DN的發(fā)病機(jī)制并早期干預(yù)DN的進(jìn)展有重要的理論意義及使用價(jià)值。

目前認(rèn)為，腎小球損傷是引起DN發(fā)生、發(fā)展的最主要因素，Kaur等[27]運(yùn)用在體外培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞，與暴露于5.5 mmol/L葡萄糖24 h相比，暴露于25 mmol/L葡萄糖24 h可導(dǎo)致TLR4 mRNA和細(xì)胞表面受體的表達(dá)有所增加；并且還發(fā)現(xiàn)MyD88、干擾素調(diào)節(jié)因子3、β干擾素Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白相關(guān)的接頭分子、NF-κB的活化炎性細(xì)胞因子IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的水平在25 mmol/L葡萄糖的存在下均顯著增加。Festa等[28]研究表明，DN患者的血漿中C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6等炎性因子的濃度均顯著升高，與24 h尿蛋白排泄量呈正相關(guān)，與內(nèi)生肌酐清除率呈負(fù)相關(guān)，提示炎性反應(yīng)與DN的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系。而TLR4是脂多糖受體復(fù)合物的重要組成部分，在體內(nèi)脂多糖能促進(jìn)免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞釋放致炎細(xì)胞因子和化學(xué)因子，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克，此過程受TLR4調(diào)節(jié)。單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等可通過TLR4接收脂多糖的刺激，經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化NF-κB，轉(zhuǎn)錄合成IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及干擾素γ等細(xì)胞因子，并使其釋放到細(xì)胞外，使毛細(xì)血管通透性增加、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腎小球功能損傷[29]。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管損傷在DN的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[30]。腎小管損傷與腎小球損傷同時(shí)發(fā)生在DN早期，腎小管上調(diào)TLR4的內(nèi)源性配體HMGB1，在體外高糖誘導(dǎo)TLR4通過蛋白激酶C激活，上調(diào)IL-6和趨化因子，通過核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB配體2的表達(dá)激活人近端腎小管上皮細(xì)胞，TLR4干擾RNA衰減高糖誘導(dǎo)的核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB的活化，抑制合成IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1，表明TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路在DN可促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥[31]。

3.3糖尿病周圍神經(jīng)病變 目前超過50%的糖尿病患者都存在神經(jīng)病變，其主要是由于高血糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性和神經(jīng)血管血流減少導(dǎo)致的缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷。有證據(jù)表明，神經(jīng)性疼痛，神經(jīng)損傷產(chǎn)生具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)免疫組分。在神經(jīng)損傷后，TLR4釋放其配體飽和脂肪酸，與膜結(jié)合，相互作用誘導(dǎo)NF-κB激活和環(huán)氧化酶2及其他炎性標(biāo)志物的上調(diào)[32]。直接參加TLR4表達(dá)的趨化因子、整合和黏附因子都有助于中樞敏感化，稱為行為超敏反應(yīng)。也就是說，TLR4表達(dá)是一個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞傳感器觸發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞激活和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，因此通過激活TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)激活，導(dǎo)致中樞敏感化和神經(jīng)損傷引起行為超敏反應(yīng)。還有研究證實(shí)，通過鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病的大鼠表現(xiàn)出強(qiáng)勁的痛覺過敏，可使TLR4 mRNA表達(dá)上調(diào)，并且激活TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生炎性因子，表明TLR4是治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的一個(gè)新目標(biāo)[33]。

4 展 望

TLR4信號(hào)通路在評(píng)估糖尿病并發(fā)癥過程中起著至關(guān)重要的作用，尤其是糖尿病微血管并發(fā)癥，及早的對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，能延緩其發(fā)生，特別是DN，TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為其早期預(yù)防提供了新的靶點(diǎn)。其通過腎小球及腎小管損傷而誘導(dǎo)DN的發(fā)生機(jī)制，需要大量深入的研究來闡明，為早期診斷糖尿病微血管并發(fā)癥并予以有效治療提供新的理論依據(jù)。

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