曹娟 呂伯昌

西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安710004

藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜的影響

曹娟 呂伯昌

西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安710004

目的建立兔慢性高眼壓模型，分析藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔眼視網(wǎng)膜的作用效果。方法選取120只新西蘭家兔，隨機(jī)分為對(duì)照組、高眼壓模型組以及干預(yù)治療組，每組40只共80眼。高眼壓模型組以及干預(yù)治療組家兔通過注射復(fù)方卡波姆溶液建立慢性高眼壓模型，干預(yù)治療組家兔每日靜脈推注藏紅花提取液。在建立模型后的7 d、14 d以及4周，各組分別處死10只動(dòng)物，利用光鏡觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化，并檢測視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）水平，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果高眼壓模型組及干預(yù)治療組視網(wǎng)膜均發(fā)生腫脹、萎縮，與高眼壓模型組相比，干預(yù)治療組損傷程度較輕；建立模型7d時(shí)，高眼壓模型組及干預(yù)治療組SOD值明顯低于對(duì)照組，MDA含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但干預(yù)治療組指標(biāo)變化幅度明顯小于高眼壓模型組（P＜0.05）；建立模型14 d時(shí)，高眼壓模型組及干預(yù)治療組SOD明顯恢復(fù)，接近正常水平，MDA含量仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)治療組RGCs數(shù)目為（287.62±23.54）個(gè)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高眼壓模型組RGCs數(shù)目為（62.78±10.24）個(gè)，顯著低于對(duì)照組及干預(yù)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論藏紅花提取液能夠保護(hù)慢性高眼壓兔眼視網(wǎng)膜功能，可作為青光眼的有效治療藥物。

藏紅花；眼高壓；視網(wǎng)膜；超氧化物歧化酶；丙二醛；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

青光眼作為臨床常見眼病之一，主要特征為視神經(jīng)萎縮和視野缺損，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡以及神經(jīng)纖維病變是引發(fā)視神經(jīng)功能損害的主要病理基礎(chǔ)[1-2]。藏紅花提取液是羥自由基與超氧自由基的強(qiáng)效清除劑，能夠抗氧化反應(yīng)[3]，改善線粒體功能，抑制視神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。本文著重分析藏紅花提取液對(duì)慢性高眼壓兔眼視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）水平影響，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年清潔級(jí)新西蘭家兔120只，體重2000～2500 g，雌雄兼用。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用裂隙燈顯微鏡以及眼底鏡檢查雙眼證實(shí)雙眼眼壓以及視網(wǎng)膜正常，未發(fā)現(xiàn)眼部疾病。采用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組、高眼壓模型組以及干預(yù)治療組，每組各40只家兔。遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)制訂的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、飼養(yǎng)方式、兔齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器

復(fù)方卡波姆溶液（上海申興制藥廠生產(chǎn)的卡波姆-940+山西雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)的地塞米松）；丁卡因滴眼液（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；氯霉素滴眼液（武漢天天明藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H34024067）；速眠新注射液（解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所）；藏紅花（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科）；SOD分析試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MDA分析試劑盒（南京建成生物工程研究所）；立式壓力蒸汽滅菌器、電子天平、低溫高速離心機(jī)、流式細(xì)胞分析儀、分光光度計(jì)以及共聚焦顯微鏡等均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 藏紅花提取液制備

稱取15 g藏紅花，加蒸餾水煮沸后過濾2次，減壓濃縮濾液，添加950 mL/L乙醇（濃縮濾液與乙醇比例為1∶3），沉淀24 h，再次過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾對(duì)乙醇進(jìn)行回收后，稀釋到100 mL裝瓶，蒸汽滅菌后放置在冰箱中（-4℃）保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成50 g/L。

1.4 模型制備

參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行慢性高眼壓模型制備。高眼壓模型組以及干預(yù)治療組新西蘭家兔耳緣靜脈注射速眠新（劑量標(biāo)準(zhǔn)為每公斤0.1 mL），全身麻醉后應(yīng)用5 g/L丁卡因滴眼液行雙眼表面麻醉，用1 mL注射器在角膜緣穿刺形成小針孔，在小針孔對(duì)側(cè)角膜緣穿刺，抽出0.2 mL房水，注入復(fù)方卡波姆溶液0.2 mL，制成慢性高眼壓模型。實(shí)驗(yàn)期間眼壓范圍應(yīng)為32～39 mm Hg[6]（1 mm Hg=0.133 kPa），并持續(xù)4周。對(duì)照眼僅采取前房穿刺。

1.5 用藥方法

每日上午8∶00～9∶00干預(yù)治療組固定新西蘭白兔后耳緣靜脈注射藏紅花提取液，劑量為40 mg/kg；高眼壓模型組和對(duì)照組給予生理鹽水，每日1次。高眼壓模型組和干預(yù)治療組每日測量眼壓，如果出現(xiàn)眼壓低于32 mm Hg，則持續(xù)注入復(fù)方卡波姆溶液。1個(gè)月為1個(gè)療程。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

成功建模后7 d、14 d及4周各組分別選取10只動(dòng)物進(jìn)行空氣栓塞處死，處死動(dòng)物后立即摘除雙側(cè)眼球，去除晶狀體及玻璃體，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，觀察視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)改變，并檢測SOD、MDA水平以及RGCs。

1.6.1 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察摘除大鼠眼球，應(yīng)用4%中性甲醛溶液進(jìn)行固定后，剪除角膜及晶狀體，采用乙醇脫水以及二甲苯透明，石蠟包埋后采取矢狀切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。

1.6.2 SOD活性檢測應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法。視網(wǎng)膜組織勻漿經(jīng)離心（3500 r/min）處理10 min，留取上清液檢測SOD活性。測定管及對(duì)照管分別加入試劑或樣品，充分混勻后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入顯色劑后混勻，靜置10 min倒入光徑比色杯中，在波長550 nm處用蒸餾水調(diào)零，比色測定各樣本A值，依據(jù)公式計(jì)算SOD活性。

1.6.3 MDA含量檢測應(yīng)用TBA比色法。離心（3500 r/min）處理視網(wǎng)膜勻漿10 min，取上清液待測。標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管以及測定管中分別加入TBA或樣品，旋渦混勻器混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，刺一小孔，放置在水浴箱中（95℃）作用40 min后取出，流水冷卻，離心（3500 r/min）處理10 min，取上清液置入光徑比色杯，在波長532 nm處采取蒸餾水調(diào)零處理，比色測定A值，按公式計(jì)算MDA含量。

1.6.4 RGCs數(shù)目檢測慢性高眼壓持續(xù)4周時(shí)，新西蘭白兔應(yīng)用大劑量速眠新注射液進(jìn)行耳緣靜脈內(nèi)注射，深度麻醉后，摘取眼球，縫線定位角膜緣的6點(diǎn)以及12點(diǎn)鐘位置，剪除角膜、虹膜、晶體以及玻璃體，將剩余眼球壁置于Bouin液中固定，24 h后應(yīng)用二甲苯進(jìn)行透明處理，常規(guī)浸蠟、石蠟包埋、切片（均通過視乳頭、6點(diǎn)鐘以及12點(diǎn)鐘方位）、染色以及封片，制成光鏡切片后，利用HPIAS-1000圖象測量系統(tǒng)計(jì)數(shù)RGCs數(shù)目，同時(shí)對(duì)視乳頭兩側(cè)5 cm范圍內(nèi)的RGCs數(shù)目進(jìn)行測量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變

建模14 d后觀察各組視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變，對(duì)照組：視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，邊緣清晰（圖1A）；高眼壓模型組：視網(wǎng)膜全層高度水腫，神經(jīng)纖維層、外內(nèi)叢狀層明顯水腫，細(xì)胞核腫脹，周圍可見空泡變性（圖1B）；治療干預(yù)組：視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層發(fā)生腫脹，視網(wǎng)膜可見輕度萎縮，與高眼壓模型組相比，程度較輕，內(nèi)外核層密度較大（圖1C）。

圖1 建模14 d后各組視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察（HE，400×）

2.2 各組SOD活性及MDA含量比較

建模7 d時(shí)，高眼壓模型組及治療干預(yù)組SOD值明顯降低，MDA含量顯著上升，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但干預(yù)治療組SOD值明顯高于高眼壓模型組，MDA含量顯著低于高眼壓模型組（P＜0.05）；建模14 d時(shí)，高眼壓模型組及干預(yù)治療組SOD明顯上升，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是MDA含量仍高于正常水平，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SOD活性及MDA含量比較（x±s）

2.3 各組RGCs數(shù)目比較

建立模型4周后觀察各組RGCs數(shù)目，對(duì)照組：未見明顯損害，細(xì)胞具有完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核呈單層均勻排列，未見細(xì)胞丟失，RGCs數(shù)目為（303.69±24.87）個(gè)（圖2A）；高眼壓模型組：可見損害嚴(yán)重，發(fā)生節(jié)段性丟失，可見部分體積腫大及空泡樣變性細(xì)胞，殘存細(xì)胞大小不等，細(xì)胞核變小，出現(xiàn)核固縮，RGCs數(shù)目為（62.78±10.24）個(gè)（圖2B），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)治療組：損傷現(xiàn)象不明顯，細(xì)胞呈單層線狀的均勻排列，未見明顯細(xì)胞丟失征象，RGCs數(shù)目為（287.62±23.54）個(gè)（圖2C），與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 建模4周后各組RGCs情況觀察（HE，400×）

3 討論

高眼壓作為青光眼的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7-10]，能夠顯著增加致盲性眼病青光眼發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。而隨著臨床關(guān)于青光眼的深入研究，其相關(guān)病理機(jī)制研究證實(shí)，青光眼視神經(jīng)損害的主要機(jī)制為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生進(jìn)行性死亡，視神經(jīng)纖維發(fā)生丟失。目前已知的對(duì)青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用的因素主要為神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪、毒素興奮性增加、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、一氧化氮代謝紊亂、氧自由基過量、內(nèi)皮素增多、細(xì)胞凋亡基因表達(dá)上升以及自體免疫機(jī)制異常等[11-13]。并且自由基對(duì)細(xì)胞衰老過程、小梁網(wǎng)細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)以及退行性改變具有重要影響。目前抑制視神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)視神經(jīng)已經(jīng)成為臨床防治青光眼的主要手段之一。SOD作為抗過氧化物酶之一，能對(duì)超氧陰離子歧化反應(yīng)起催化作用，是活性氧的主要防御屏障，SOD活性降低，將導(dǎo)致自由基堆積。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)指標(biāo)，能夠損傷視網(wǎng)膜組織。

中藥研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花不但鎮(zhèn)靜、祛痰、解痙、活血效果顯著，而且具有良好的抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元作用。藏紅花作為臨床常用中藥之一，主要功效為行氣活血、祛瘀化痰?，F(xiàn)代研究證實(shí)[14]，藏紅花不僅能夠抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改善微循環(huán)，而且能夠清除自由基，具有強(qiáng)效超氧化物清除活性，能夠調(diào)節(jié)眼部血液血循，恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。藏紅花提取液有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用，可改善慢性高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺血程度，顯著保護(hù)視神經(jīng)細(xì)胞[15]。

本實(shí)驗(yàn)中，在建立兔慢性高眼壓模型的基礎(chǔ)上，檢測SOD活性、MDA含量以及RGCs數(shù)目，通過與正常兔和模型兔比較，證實(shí)了藏紅花提取液能夠顯著減輕視網(wǎng)膜損傷程度，提高SOD活性，降低MDA含量，顯著抑制視神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，藏紅花提取液能夠降低慢性高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷，具有保護(hù)視網(wǎng)膜功能的作用，值得臨床深入探討。

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Influence of saffron extract on the retina of rabbit with chronic ocular hypertension

CAO JuanLU Bochang
Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Shaanxi Province,Xi'an710004,China

Objective To establish a rabbit model of chronic ocular hypertension,analyze saffron extract effects for retina of rabbits with chronic high intraocular pressure.Methods 120 New Zealand rabbits were randomly divided into control group,model group and high IOP intervention group,40 cases(80 eyes)in each group.Ocular model group and intervention group were established rabbits chronic ocular hypertension model by injecting carbomer solution,rabbits in the intervention group were given daily intravenous injection of saffron extract.After model establishment for 7 d,14 d and 4 week,each group were sacrificed 10 animals.Retinal morphological changes were observed by light microscope, then superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),retinal ganglion cells(RGCs)levels were detected.The results were analyzed.Results The retinal had swelling,shrinking in the intervention group and model group,compared with the model group,the degree of damage was less in the intervention group.After model establishment for 7 d,SOD levels in the model group and intervention group were significant lower than the control group,and MDA levels in the model group and intervention group were significant higher than the control group,with statistically significant difference(P＜0.05),but the rangeability in the intervention group was less than the model group(P＜0.05).After model establishment for 14 d,SOD levels in the model group and intervention group had recovered to normal level,but MDA levels still higher than the control group,with statistically significant difference(P＜0.05).The number of RGCs in the intervention group was(287.62±23.54),compared with the control group,the difference was not statistically significant (P＞0.05).The number of RGCs in the model group was(62.78±10.24),which was significantly lower than the intervention group and the control group,with statistically significant difference(P＜0.05).Conclusion Saffron extract can protect retinal function of rabbits with chronic high intraocular pressure,can be used as an effective therapy for glaucoma. [Key words]Saffron;Ocular hypertension;Retina;SOD;MDA;RGCs

R285.5

A

1673-7210（2014）09（a）-0004-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81273902）。

曹娟（1981-），女，陜西西安人，碩士；研究方向：青光眼、白內(nèi)障。