魏 璇 張一兵 杜 雪 馬雪梅 杜秀英

子宮頸癌(cervix carcinoma,CC)是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，病死率已躍居各類婦科惡性腫瘤之首[1]。本研究采用免疫組化法監(jiān)測(cè)P16蛋白在宮頸上皮內(nèi)病變、子宮頸癌組織中的表達(dá)，以確定其能否作為檢測(cè)宮頸癌的生物標(biāo)志物，以提高宮頸癌的篩查和診斷。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集我院2009年1月-2010年6月宮頸癌石蠟標(biāo)本65例(其中活檢標(biāo)本31例，手術(shù)標(biāo)本34例),宮頸上皮內(nèi)病變CIN組90例(其中CINⅠ30例，CINⅡ30例，CINⅢ 30例)作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)，隨機(jī)選取同期因良性病變行全子宮切除的正常宮頸組織30例作為對(duì)照組。入選病例既往均無放療、化療及激素治療史。

1.2 主要試劑和方法

P16抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用S-P法，免疫組織化學(xué)方法參照試劑盒說明進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

P16以腫瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性表達(dá)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性數(shù)進(jìn)行判斷，采用高倍視野隨機(jī)記數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞所占比例，分為4級(jí)，≤5%為陰性(-)，6%～25%為輕度陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)占26%～75%為中度陽性(++),>75%以上為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用卡方(χ2)檢驗(yàn)及Fisher確切概率計(jì)算法，以檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸組織中P16的表達(dá)

宮頸癌中 P16陽性細(xì)胞彌漫型或呈灶狀分布,呈粗大顆粒狀,著色深，呈陽性表達(dá)。從正常組織、CIN到宮頸組織癌變過程中，P16蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽性細(xì)胞逐漸增多并出現(xiàn)于子宮頸上皮全層，染色范圍與病變細(xì)胞呈明顯正相關(guān)。在正常對(duì)照組、CIN組、宮頸癌組中P16陽性表達(dá)率分別為6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=85.596，P<0.001)。

2.2 P16在CIN組各級(jí)別及宮頸癌組中的表達(dá)

P16在CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、宮頸癌組的陽性表達(dá)率分別為40.0%(12/30)、76.7%(23/30)、93.3%(28/30)、100.0%(65/65)；CIN各組組間相比，CIN各組與宮頸癌組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=54.664，P<0.001)。

3 討論

宮頸癌嚴(yán)重危害婦女身心健康，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，是多因素參與的多步驟的復(fù)雜過程，是從非典型增生、CIN、原位癌再到浸潤癌的漸進(jìn)過程。研究表明[2]，CIN Ⅰ級(jí)發(fā)展到CIN Ⅲ級(jí)的平均時(shí)間為9年，再發(fā)展到浸潤性癌則需要3個(gè)月到2年，宮頸癌5年存活率為67%，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變存活率為100%，故宮頸癌的早期篩查和診斷是降低發(fā)生的關(guān)鍵。

在宮頸癌演變過程中，抑癌基因表達(dá)失活和癌基因的表達(dá)激活是其細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)，在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)個(gè)抑癌基因中，P16基因與宮頸癌的關(guān)系密切[3]。P16基因是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的抑癌基因，編碼蛋白可與細(xì)胞周期蛋白D競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4/6，干擾CDK4/6與細(xì)胞周期蛋白D的結(jié)合，阻止細(xì)胞從G1期發(fā)展至S期，抑制細(xì)胞增殖，防止惡性變。有研究顯示許多惡性腫瘤存在P16基因表達(dá)異常[4]。但P16在宮頸癌的表達(dá)比較復(fù)雜，江濤等[5]用免疫組織化學(xué)方法研究了102例宮頸組織，其中30例正常宮頸組織中P16蛋白基本為陰性，CIN和宮頸癌組織中P16蛋白的陽性表達(dá)率分別為30%和63.5%，Bleotu等[6]研究也證實(shí)了這一結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)顯示在正常宮頸組織向CIN、宮頸癌演變過程中，隨著宮頸病變級(jí)別的升高，P16蛋白的陽性表達(dá)率逐漸升高，在正常對(duì)照組、CIN組、宮頸癌組分別為6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)，提示P16的異常表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

P16在宮頸癌中表達(dá)增加的原因可能與HPV感染有關(guān)[7]，因?yàn)閷m頸癌患者多伴有HPV感染，HPV病毒表達(dá)E7蛋白，E7蛋白與pRb蛋白結(jié)合并使之失活，而失活的Rb基因可以反饋性刺激P16表達(dá)水平升高。Munoz等在對(duì)高危型HPV感染的宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)，P16表達(dá)與HPVl6/18表達(dá)呈正相關(guān)[7]，說明P16的過表達(dá)是繼發(fā)于HPV表達(dá)的，提示P16蛋白表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生的早期事件。

綜上所述，P16可作為宮頸上皮的非腫瘤性增生和腫瘤性增生鑒別診斷的標(biāo)志物。P16蛋白水平對(duì)診斷宮頸高度病變有較高的敏感性和特異性。研究結(jié)果亦提示P16蛋白檢測(cè)可以預(yù)測(cè)宮頸病變的生物學(xué)潛能及其發(fā)展的臨床結(jié)果，可用于宮頸高度病變的篩查。

[1] Wang SS，Sherman ME，Hildesheim A，et al.Cervical adenocarcinoma and squamous cell carcinoma incidence trends among white women and black women in the United States for 1976-2000〔J〕.Cancer，2004，100(5)：1035-1044.

[2] Uhis E,Hymowitz SG,Cochran AG.The mitotic regulator S-urvivin binds as a monomer to its functional interactor Bo-realin〔J〕.J Biol Chem,2007,282(48):35018-35023.

[3] 鄒先進(jìn)，蔡 蘭，劉 穎，等.子宮頸癌前病變與子宮頸癌組織中p16蛋白檢測(cè)及其與人乳頭瘤狀病毒感染的關(guān)系〔J〕.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39(9)：625-626.

[4] 范 昭，葉 靜，龍 霞，等.P16基因在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中甲基化的研究〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2011，26(1)：34-36.

[5] 江 濤，李隆玉，潘 玫，等.p16在宮頸癌組織中的表達(dá)及其意義〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2005，20(6)：581-587.

[6] Bleotu C,Botezatu A,Goia CD,et al.P16INK4A-A possible marker in HPV persistence screening〔J〕.Roum Arch Microbiol Immunol,2009,68(3)：183-189.

[7] Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillonlavirus types associated with cervical cancer〔J〕.N Engl J Med，2003，348(6)：518-527.