王建舫

（北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點實驗室，北京 102206）

雞致病性大腸桿菌的分離鑒定

王建舫

（北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點實驗室，北京 102206）

無菌采取病死雞腦、肝臟、脾臟和腎臟接種于麥康凱瓊脂平板，分離出特征性的大腸桿菌菌落，經(jīng)生化和血清型鑒定，鑒定出該分離菌為腸埃希氏菌1型，血清型為O78，但與O92血清型有很高的交叉。藥敏試驗結(jié)果顯示：該分離菌株對頭孢拉定、頭孢噻吩和頭孢氨芐有耐藥性，而對頭孢曲松中度敏感，對卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感。致病力試驗顯示：腿部肌肉注射的雛雞全部死亡，腹腔注射的雛雞部分死亡，其他雞只健康存活。

大腸桿菌；血清型；耐藥性；致病力

雞大腸桿菌病是由致病血清型大腸桿菌引起雞的細菌性傳染病，臨床上可表現(xiàn)為急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、眼炎、關(guān)節(jié)炎、臍炎、肉芽腫以及肺炎等，最常見的是急性敗血癥和卵黃性腹膜炎[1]。各品種和日齡的雞均可感染，但是肉仔雞最易感。為控制大腸桿菌在肉仔雞群中的傳播，本實驗室對送檢的病、死肉雛雞進行了病原的分離鑒定，并對分離菌進行了藥敏試驗和致病力試驗，為有效防制該雞場的大腸桿菌病提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2012年11月河北某肉種雞場送檢的疑似大腸桿菌病的3日齡病死雞，至送檢時已損失7%。

1.2 剖檢癥狀

趾部和頭部部分雞輕微發(fā)紺，外觀不見明顯脫水，肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩。脾臟4/6紫紅，少血，腎臟4/6出血，臍帶部位有出血點。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

無菌采取病死雞的腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h，然后挑取玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤邊緣整齊的單個菌落分別接種于麥康凱瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18h[2]。培養(yǎng)好的麥康凱瓊脂平板放于4℃冰箱備用。

1.4 細菌學(xué)形態(tài)觀察

培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯抹片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.5 細菌的鑒定

生化實驗由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心用法國梅里埃生化鑒定卡進行。血清型分型由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和本實驗室同時進行。

1.6 藥敏試驗

挑取玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤邊緣整齊的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)。待菌液OD600值達到0.25[3]時，用無菌棉拭子蘸取菌液，于管壁上擠去多余液體，涂布整個MH瓊脂表面，反復(fù)涂布幾次，每次將平面旋轉(zhuǎn)60度，保證涂布均勻。蓋上平皿室溫下放置5min，使培養(yǎng)基表面的水分吸收掉，用無菌眼科鑷子將含卡那霉素、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢曲松、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的藥敏紙片貼于平皿上，每個平皿貼5種藥敏紙片，紙片與紙片中心距離不得小于24mm。紙片貼好后15min內(nèi)，將平皿倒放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)20h。結(jié)果判斷依據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗操作標準（第四版）》進行。

1.7 致病力試驗

1.7.1 菌液制備

將分離菌接種于3ml營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)3～4h，使其細菌數(shù)達到2*108CFU/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 動物試驗

（如下表所示）1日齡健康肉雞36只，隨機分成A、B、C、D四個大組，每個大組又隨機分為1、2、3三個小組，其中4個1組按不同的接種途徑接種細菌菌液100ul，接種劑量為2*107CFU；同樣2組也按不同的接種途徑接種細菌菌液100ul，接種劑量為2*106CFU；3組接種100ul滅菌生理鹽水作為對照。隔離飼養(yǎng)。死亡雞只死后立即剖檢，未死雞只6天全部剖檢，所有的雞無菌采取腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h。

2 結(jié)果

2.1 病死雞的病理剖檢變化

外觀不見明顯脫水，腦內(nèi)未見明顯變化，肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩。脾臟4/6紫紅，少血，腎臟4/6出血；部分雞有“三炎”癥狀。

2.2 細菌分離

在營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h后，形成中等大小，圓形微凸起，表面光滑濕潤，淺灰色半透明大菌落。在麥康凱瓊脂平板上7℃培養(yǎng)18h后，形成玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤邊緣整齊的大菌落。

2.3 細菌形態(tài)學(xué)觀察

取病死雞腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織培養(yǎng)物涂片染色鏡檢，均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.4 細菌鑒定結(jié)果

2.4.1 生化試驗結(jié)果

生化試驗結(jié)果顯示，此次分離的大腸桿菌對硝基-苯-β-D-吡喃半乳糖苷酶、賴氨酸、鳥氨酸、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、色氨酸顯示陽性，檸檬酸鈉、苯丙氨酸鹽、丙二酸、七葉靈、阿東醇、纖維二糖、丙酮酸鹽、細胞色素氧化酶顯示陰性結(jié)果。根據(jù)法國梅里埃生化鑒定編碼冊，本實驗室分離的細菌符合大腸埃希氏菌1型的特征。

2.4.2 血清型試驗

血清型實驗結(jié)果顯示：此次分離的大腸桿菌能夠與O78和O92單因子血清進行玻板凝集，試管凝集反應(yīng)的凝集價分別為640和320，故判斷該大腸桿菌的血清型為O78。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示：頭孢拉定、頭孢噻吩和頭孢氨芐沒有抑菌圈，該分離菌株對這三種藥物有耐藥性，而對頭孢曲松中度敏感，對卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感。建議該場慎用頭孢類和青霉素類藥物，輪換使用卡那霉素和慶大霉素等氨基糖苷類和喹諾酮類藥物。

2.6 致病力試驗

A1組雛雞48h內(nèi)全部死亡，A2組雛雞在72h內(nèi)全部死亡，C1組66h有1只死亡，C1組其他雛雞和其他組雛雞健康存活。剖檢：死亡雞肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩，脾臟紫紅，少血，腎臟出血，有“三炎”癥狀，與發(fā)病病死病理變化相似。其他雛雞沒有明顯的臨床癥狀。所有的雞無菌采取腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h，結(jié)果顯示：死亡雞只的組織培養(yǎng)物均長出玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤邊緣整齊的大菌落，未死雞的組織培養(yǎng)物均未長菌。

3 小結(jié)與討論

（1）致病性大腸桿菌廣泛存在于患病雞，隱性感染雞的體內(nèi)和外界環(huán)境中，易感雞群可通過飼料飲水經(jīng)消化道傳播。通風(fēng)不良、密度過大、應(yīng)激、環(huán)境衛(wèi)生較差、飼料營養(yǎng)部全及某些疫苗的免疫接種等都可促進本病的發(fā)生。該場的種雞由國外空運而來，進雞后34h開始發(fā)病死亡，但是同一棟的4欄中只有2欄發(fā)病，另外2欄未見異常。懷疑是在運輸途中由于運輸工具消毒不徹底或者該場的器具消毒不徹底造成了致病性大腸桿菌經(jīng)臍帶進入雛雞體內(nèi)而發(fā)生的感染。

（2）在藥敏試驗結(jié)果的指導(dǎo)下，該場于4日齡應(yīng)用敏感性藥物，9日齡時死亡基本控制住，說明我們的耐藥性試驗對于生產(chǎn)上臨床用藥起到了指導(dǎo)作用。

（3）大腸桿菌臨床分離菌株通過不同的途徑和不同的劑量接種雛雞，結(jié)果顯示：在腿部肌肉、口服、腹腔注射和滴鼻四種途徑接種途徑中，腿部肌肉注射的致病性最強，腹腔注射次之，而口服和滴鼻無可見的致病性癥狀，也沒有分離到接種菌，可能是由于致病菌沒有進入機體或者是由于多數(shù)細菌從消化道和呼吸道道排除體外，從而使實際進入機體的細菌量大大減少而使機體耐過。

[1] 吳清民.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2001：156-161.

[2] 曹澍澤.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992.

[3] F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓等，精編分子生物學(xué)實驗指南[M].科學(xué)出版社，1998：6-7.

2.6 杜絕污染，合理用藥

畜禽尿、便等污物要按規(guī)定達標后排放，嚴禁對環(huán)境造成污染。對病死畜要按有關(guān)規(guī)定處理，不得隨意丟棄、宰殺或處理。發(fā)病時切忌隨意用藥，以防影響疫病防治效果和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量。

2.7 全面培訓(xùn)，科學(xué)飼養(yǎng)

對養(yǎng)殖戶要開展技術(shù)培訓(xùn)，使他們盡快掌握畜禽飼養(yǎng)管理技術(shù)，做到戶戶科學(xué)養(yǎng)殖，從而提高養(yǎng)殖技術(shù)水平，擴增養(yǎng)殖小區(qū)建設(shè)的實效。

2.8 加強管理，完善制度

養(yǎng)殖小區(qū)由于養(yǎng)殖密度高，必須加強統(tǒng)一管理并建立相應(yīng)的制度。如小區(qū)人員和物品出入管理制度、獸藥、疫苗購進使用登記管理制度等。

在庭院式經(jīng)營弊端出現(xiàn)后，人們選擇了養(yǎng)殖小區(qū)，它以“小農(nóng)戶、大群體”的畜牧業(yè)新型組織形式出現(xiàn)，進行著畜禽養(yǎng)殖的標準化、規(guī)范化生產(chǎn)。而構(gòu)筑養(yǎng)殖小區(qū)的“生物安全”屏障，則是解決畜牧業(yè)發(fā)展瓶頸問題的重要途徑，也是實現(xiàn)動物安全生產(chǎn)及其產(chǎn)品質(zhì)量安全衛(wèi)生的必然選擇，同時可以加速推進畜牧業(yè)規(guī)?；⒁?guī)范化、標準化和安全化生產(chǎn)的進程。