潘丹玲 陳小巖 林潔 李峰 陳新

胃癌組織HER－2基因擴增和蛋白表達檢測及臨床意義

潘丹玲 陳小巖 林潔 李峰 陳新

目的 探討免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測胃癌HER－2蛋白表達和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法檢測HER－2基因擴增的臨床意義。方法收集256例胃癌患者手術(shù)切除及胃鏡活檢的胃癌組織標本，分別采用IHC法及FISH法檢測胃癌組織HER－2蛋白表達及基因擴增狀態(tài)，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果256例胃癌組織標本中，有26例HER－2蛋白表達陽性，陽性率為10．16%；46例HER－2基因有擴增，陽性率17．97%。26例HER－2蛋白表達（3＋）的標本中，24例有HER－2基因擴增，2例無擴增；95例HER－2蛋白表達（2＋）的標本中，20例有基因擴增，75例無擴增；90例HER－2蛋白表達（1＋）的標本中，2例有基因擴增，88例無擴增；45例HER－2蛋白表達（0）的標本中，HER－2基因均無擴增。IHC法和FISH法檢測HER－2表達陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論IHC法檢測胃癌HER－2蛋白表達可作為臨床治療的初篩，HER－2蛋白表達（2＋）的患者應(yīng)常規(guī)行FISH法，以確定HER－2基因擴增狀態(tài)。FISH法檢測結(jié)果具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，聯(lián)合IHC法可更準確和客觀評價胃癌預(yù)后，并指導(dǎo)臨床選用靶向藥物治療。

胃癌；HER－2基因；免疫組織化學(xué)；熒光原位雜交

胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是世界第二致死癌癥，中國為高發(fā)區(qū)。該病預(yù)后差，早期診斷較困難，絕大多數(shù)患者直到晚期才出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。進展期胃癌患者約20%表現(xiàn)人表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor2，HER－2）蛋白過表達或基因擴增，HER－2蛋白過表達能預(yù)測多種化療藥物及內(nèi)分泌治療的敏感性，并指導(dǎo)靶向治療藥物（曲妥珠單抗）的選擇。一項包括中國在內(nèi)的24個國家參與的全球多中心隨機對照III期臨床研究（ToGA試驗）［1］的結(jié)果顯示，化療聯(lián)合曲妥珠單抗可顯著延長進展期胃癌患者的生存期。所以，正確檢測和評定HER－2蛋白表達和基因擴增對胃癌臨床治療和預(yù)后判斷有重要價值。2010年歐洲藥品管理局及美國食品藥品監(jiān)督管理局先后批準化療聯(lián)合使用曲妥珠單抗治療HER－2陽性胃癌患者。參照2009年《乳腺癌HER－2檢測指南》，我國于2011年發(fā)布《胃癌HER－2檢測指南》［2］，本文研究按照該指南，應(yīng)用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測胃癌HER－2蛋白表達和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法檢測HER－2基因擴增水平，為正確評估胃癌患者預(yù)后及臨床選擇治療方案提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇我院2012年1月至2013年6月手術(shù)切除及胃鏡活檢的胃癌標本256例，術(shù)前或活檢前均未接受放、化療及免疫治療，均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為胃癌。其中男性120例，女性136例，平均年齡（40．5±10．0）歲。腫物直徑最小0．5 cm，最大13．5 cm。具體臨床病理資料見表1。

表1 256例胃癌患者的臨床病理參數(shù)

1.2 方法送檢組織在離體后20－30min內(nèi)進行標記、切開，采用新鮮配制的4%中性緩沖甲醛液固定，固定時間為8－24 h；石蠟包埋、切片脫蠟、HE染色，IHC采用Elivision二步法，以已知HER－2 IHC（3＋）的胃癌組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照。HER－2抗體克隆號為SP3，為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。Path Vysion HER－2 DNA探針試劑盒購自美國Vysis公司。

1.2.1 IHC法檢測HER－2蛋白表達根據(jù)《胃癌HER－2檢測指南》［2］評判標準，對于手術(shù)標本，光鏡下觀察結(jié)果，≥10%腫瘤細胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色，判為HER－2（3＋）；≥10%的腫瘤細胞有弱至中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色，判為HER－2（2＋）；≥10%腫瘤細胞微弱或隱約可見膜著色，僅有部分細胞膜染色，判為HER－2（1＋）；無反應(yīng)或＜10%腫瘤細胞膜染色，判為HER－2（0）。對于活檢標本，光鏡下觀察結(jié)果，腫瘤細胞的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色（不管著色的腫瘤細胞占整個組織的百分比，但至少有5個成簇的腫瘤細胞著色），判為HER－2（3＋）；腫瘤細胞團有弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色（不管著色的腫瘤細胞占整個組織的百分比，但至少有5個成簇的腫瘤細胞著色），判為HER－2（2＋）；腫瘤細胞團微弱或隱約可見膜染色（不管著色的腫瘤細胞占整個組織的百分比），判為HER－2（1＋）；任何腫瘤細胞無膜染色，判為HER－2（0）。HER－2蛋白表達（3＋）判定為陽性表達（過表達），其余均為陰性表達。

1.2.2 FISH法檢測HER－2基因擴增水平胃癌HER－2原位雜交判讀方法參照ToGA研究經(jīng)驗［3］，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，選擇擴增程度最高的區(qū)域，計數(shù)至少20個腫瘤細胞核中的雙色信號，統(tǒng)計Ratio值（Ratio＝20個細胞核中紅色信號總數(shù)／20個細胞核中綠色信號總數(shù)，即HER－2與CEP17的比值）。Ratio≥2．2為陽性，提示HER－2基因擴增；Ratio＜1．8為陰性，提示HER－2基因無擴增；Ratio在1．8～2．2為不確定，需要再計算20個細胞核中的信號或由另一位醫(yī)師重新計數(shù)，若Ratio≥2．0判為陽性，Ratio＜2．0判為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IHC法檢測HER－2蛋白表達結(jié)果256例胃癌患者的組織標本中，有26例HER－2蛋白表達為（3＋），陽性率為10．16%，95例HER－2蛋白表達為（2＋），陽性率為37．11%，90例HER－2蛋白表達為（1＋），陽性率為35．16%，45例無HER－2蛋白表達。HER－2蛋白表達結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 胃癌HER－2蛋白表達為（3＋）

圖2 胃癌HER－2蛋白表達為（2＋）

圖3 胃癌HER－2蛋白表達為（1＋）

圖4 胃癌HER－2蛋白表達為（0）

2.2 FISH法檢測HER－2基因擴增結(jié)果256例胃癌患者的組織標本中，46例有擴增，210例無擴增，擴增率為17．97%。HER－2基因的擴增結(jié)果見圖5 、圖6 。

圖5 FISH法檢測胃癌組織HER－2基因有擴增

圖6 FISH法檢測胃癌組織HER－2基因無擴增

2.3 兩種檢測方法的比較在26例HER－2蛋白表達（3＋）的胃癌組織標本中，有24例出現(xiàn)HER－2基因擴增，2例無擴增；95例HER－2蛋白表達（2＋）的胃癌組織標本中，20例有基因擴增，75例無擴增；90例HER－2蛋白表達（1＋）的胃癌組織標本中，2例有基因擴增，88例無基因擴增；45例HER－2蛋白表達為（0）的胃癌組織標本中，均無基因擴增。IHC法檢測HER－2蛋白表達陽性率（10．16%）和FISH法檢測HER－2基因擴增陽性率（17．97%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0．782，P＞0．05），見表2。

表2 胃癌患者HER－2基因擴增及蛋白表達結(jié)果［n（%）］

3 討論

HER－2是原癌基因，定位于染色體17q21，是相對分子質(zhì)量為185×103的跨膜糖蛋白，簡稱為HER－2蛋白或受體。HER－2是一種跨膜酪氨酸激酶受體，通過與相應(yīng)配體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞生長、生存、分化和凋亡。研究［4］表明，HER－2過表達的惡性腫瘤具有更強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，患者預(yù)后較差。準確檢測HER－2狀態(tài)十分必要，可預(yù)測胃癌預(yù)后，并指導(dǎo)分子靶向藥物曲妥珠單抗的治療。曲妥珠單抗可特異性地識別癌細胞HER－2胞外域的抗原決定簇，抑制HER－2對腫瘤細胞向惡性表型的轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。臨床上，曲妥珠單抗對HER－2陽性胃癌患者具有一定的治療效果，不但降低胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，而且能肯定改善HER－2基因過表達患者的生存，使得胃癌患者在常規(guī)治療進行的基礎(chǔ)上進一步獲益。

準確檢測胃癌HER－2表達和基因擴增情況是進展期胃癌HER－2靶向治療患者篩選和治療療效預(yù)測的前提。目前，常用的HER－2蛋白與基因的檢測方法為IHC法和FISH法。HER－2蛋白檢測要求實驗室必須有規(guī)范化流程和質(zhì)量控制體系，只有嚴格遵循標準化流程的實驗過程才能提供可信賴的實驗結(jié)果［5］。

在我國各大醫(yī)院病理科實驗室，IHC法仍是HER－2蛋白檢測的主要手段。IHC法具有成本低廉、方法簡單、生物學(xué)關(guān)聯(lián)密切、可重復(fù)性好等優(yōu)點，而且IHC切片可同時觀察組織學(xué)形態(tài)，其切片可長期保存且反復(fù)評估。但是IHC法染色存在定量性不強、抗體差異、抗原修復(fù)方法不同及組織固定和制片等因素的影響，以及結(jié)果的主觀判讀等，使檢測結(jié)果受影響，導(dǎo)致不同醫(yī)院病理實驗室之間結(jié)果有較大的差異性。IHC法的這些缺陷將會影響檢測結(jié)果對臨床治療的指導(dǎo)。

FISH法是一種分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，在組織切片上顯示細胞內(nèi)特異性DNA片段。通過熒光標記的DNA探針與細胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，在熒光顯微鏡下，分析細胞核內(nèi)雜交的DNA靶序列的多種彩色探針信號，以獲得細胞內(nèi)多條染色體（或染色體片段）或多種基因狀態(tài)的信息。應(yīng)用該技術(shù)檢測HER－2基因具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此測定結(jié)果具有高度的準確性、靈敏度和特異性，其結(jié)果在不同實驗室間一致性很高。但FISH法檢測費用較高，信號強度隨時間衰減，不能同時觀察細胞形態(tài)且較難鑒定胃癌微小浸潤灶。胃癌HER－2檢測異質(zhì)性較常見，在胃癌中，有5%～30%的病例出現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性。Rüschoff等［6］研究者認為，因為胃癌的異質(zhì)性，IHC法的預(yù)測價值比FISH法高。在IHC法的染色切片上，胃癌異質(zhì)性區(qū)域可結(jié)合全片分析，而FISH法在暗視野100倍物鏡下觀察，難以在同等時間內(nèi)全面把握切片信息，因此FISH法不能作為首次或唯一決定是否適合靶向治療的檢測，而IHC法可用于胃癌患者HER－2靶向治療的初步篩選。

HER－2狀態(tài)的準確檢測和判讀需要標準化方法的支持，也需要結(jié)合足夠的臨床資料來判斷，使患者得到更有效的治療，真正成為個體化治療的受益者。本文研究對256例胃癌患者采用IHC法和FISH法檢測HER－2狀態(tài)，結(jié)果表明，IHC法和FISH法檢測HER－2結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。目前，國內(nèi)外不同研究［7－9］報道的HER－2蛋白過表達率為6．8%～34．0%。本文研究中，IHC法檢測蛋白表達（3＋）為26例，陽性率為10．16%，與以上報道一致。本文研究結(jié)果顯示，IHC法檢測HER－2無表達時，F(xiàn)ISH法檢測HER－2均無基因擴增。IHC法檢測為（2＋）時，F(xiàn)ISH法檢測陽性率為21．05%，故IHC法檢測為（2＋）的患者需要進一步行FISH法檢測來確定是否存在基因擴增。IHC法檢測（3＋）患者中，F(xiàn)ISH法檢測有2例為陰性，17號染色體多體可能是導(dǎo)致IHC法檢測強陽性而FISH法檢測為陰性的主要原因，胃癌17號染色體多體可引起HER－2蛋白表達的增強，因此，必要時這類患者應(yīng)進一步行FISH法檢測。90例IHC法檢測結(jié)果為（1＋）的患者中，有2例（2．22%）出現(xiàn)HER－2基因擴增，認為17號染色體單體可能是IHC法檢測（1＋）而FISH法檢測有基因擴增的原因。還有胃活檢小標本，因不能代表腫瘤的整體，故進一步的HER－2基因擴增檢測對IHC法檢測（0）或（1＋）的病例仍有一定意義。

綜上所述，IHC法可以用作臨床靶向藥物治療的初篩，對于IHC法檢測（0）或（1＋）及（3＋）的患者可選擇性行FISH法檢測，而對于IHC法檢測（2＋）的患者應(yīng)行FISH法檢測，以確定HER－2基因狀態(tài)來指導(dǎo)臨床的診療，臨床工作中對這部分患者進行FISH檢測的意義最大［10］。HER－2基因檢測的準確性是患者得到正確治療的基礎(chǔ)。IHC法和FISH法聯(lián)合檢測，可準確評估HER－2狀態(tài)，并準確和客觀評價胃癌患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床選用靶向藥物治療。

1 BangYJ，VanCutsemE，F(xiàn)eyereislovaA，etal．Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatmentof HER2 －postive advanced gastric or gastro －oesophageal junction cancer（ToGA）：aphase3，open－label，randomisedcontrolledtrial．Lancet，2010，376：687－697．

2 《胃癌HER－2檢測指南》編寫組．胃癌HER－2檢測指南．中華病理學(xué)雜志，2011，40：553－557．

3 ShakS．Overview of the trastuzumab（Herceptin）anti－HER2 monoclonal antibody clinical program in HER－2 overexpression metastatic breast cancer． Herceptin Multinational Investigator Study Group． Semi Oncol，1999，26：71－77．

4 Meert AP，MartinB，PaesmansM，etal．TheroleofHER－2／neu expressionon the survival of patients with lung cancer：asystematic reviewof the literature．BrJCancer，2003，89：959－965．

5 Arena V，PennacchiaI，MonegoG，etal．Fluorescent in situ hybridization as a primary test for HER－2 status in breast cancer：controversies．JClinOncol，2010，28：e83－e84．

6 Rüschoff J，DietelM，BarettonG，etal．HER2 diagnostics in gastriccancer－guideline validation and development of standardized immunohistochemical testing.VirchowsArch，2010，457：299－307．

7 Hofmann M，StossO，ShiD，etal．Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer：results from a validation study． Histopathology，2008，52：797－805．

8 武鴻美，劉艷輝，林鋒，等．中國胃癌患者HER2蛋白表達與臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系．中華病理學(xué)雜志，2011，40：296－299．

9 Rüschoff J，HannaW，BilousM，etal．HER－2 testing in gastric cancer：a practical approach．Mod Pathol，2012，25：637－650．

The clinical significance of detecting HER－2 protein expression and HER－2 gene amplification in gastric carcinoma

PAN Dan－ling,CHENXiao－yan,LIN Jie，etal,Departmentof Pathology,Fujian Provincial Hospital,Provincial Clinical Medical College of Fujian MedicalUniversity，F(xiàn)uzhou 350001，China

ObjectiveTo detect the expression of HER－2 protein by immunohistochemistry（IHC）method and HER－2 geneamplification by fluorescence in situ hybridization（FISH）method in gastric cancer，and to evaluate the clinical significance．Methods256 casesgastric cancer tissue samp les by surgical excision and gastroscopic biopsieswere collected．HER－2 gene amplification and HER－2 protein expression were examined by FISHmethod and IHCmethod respectively．All data were analyzed statistically．ResultsIn 256 samples from gastric carcinoma patients，there were 26 cases had HER－2 protein positive experssion，and 46 cases had HER－2 gene amplification．The positive rates were 10.16％ and 17.97％ respectively.There were 24 cases showed positive HER－2 gene amplification in 26 patients with HER－2 protein expression（3+），20 cases showed positive HER－2 gene amplification in 95 patients with HER－2 protein expression（2+），and 2 caseshowed positive HER－2 gene amplification in 90 patients with HER－2 protein expression（1+），There was nopositive HER－2 gene amplification in 45 patients with HER－2 protein expression（０）．The difference of these two methods in HER－2 protein expressive detection had no statistical significance（P＞0.05）．ConclusionThe IHC method detection of gastric cancer HER－2 protein expression can be used as a initial clinical screening．In cases of HER－2 protein expression（2+），HER－HER－2 gene amplification shall be detected by FISH method．FISH method has a higher stability and reliability than IHC method．The combination of FISH and IHC methods used to detect the expression of HER－2 in gastric carcinoma is the best way which guide the selection of targeted drug therapy and the evaluation of prognosis．

Gastric carcinoma；HER－2；Immunohistochemistry；Fluorescence in situ hybridization

10．3969／j．issn．1674－7151．2014．01．003

2013－11－29）

（本文編輯：楊軍）

350001 福州市，福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院病理科