張時民

專家論壇

數(shù)字圖像技術(shù)在尿液有形成分分析自動化上的應(yīng)用

張時民

尿液有形成分分析的自動化進程起步較晚，但近10余年來在國內(nèi)外都有快速發(fā)展。目前數(shù)字圖像技術(shù)在尿液有形成分分析自動化上的應(yīng)用主要為流動拍攝式和靜止拍攝式尿液有形成分分析儀兩種。本文對這兩類自動化分析設(shè)備的發(fā)展進程、檢查原理、流程和優(yōu)勢特點等方面進行介紹，指出其在實驗室檢測中的不足之處，并對改進措施和實驗室工作人員在實際工作中的正確使用予以建議。對數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展和在醫(yī)學(xué)其他領(lǐng)域的應(yīng)用進行了設(shè)想和展望。

數(shù)字圖像技術(shù)；尿液有形成分；自動化

尿液有形成分分析是一項傳統(tǒng)檢查項目，是尿常規(guī)檢驗中的一個重要內(nèi)容，也是檢驗醫(yī)學(xué)中的一個重要項目。其自動化進程起步較晚，但近10余年來在國內(nèi)外都有快速發(fā)展。本文對這些自動化分析設(shè)備的發(fā)展進程、檢查原理、流程和特點等方面進行介紹，對這類儀器的不足和改進予以建議，對其發(fā)展和進一步延伸應(yīng)用領(lǐng)域進行了設(shè)想和展望。

1 發(fā)展進程

尿常規(guī)一般包括理學(xué)檢查、化學(xué)檢查和有形成分檢查三大部分，而有形成分檢查又被稱為尿沉渣檢查。由于上世紀(jì)50年代尿干化學(xué)分析技術(shù)的開展，其自動化進程非常迅速，各種類型的尿干化學(xué)試帶和分析儀器遍布各級醫(yī)院實驗室，而顯微鏡檢查則一直停留在人工鏡檢階段。直到1983年美國Iris公司設(shè)計出一款通過電視攝像和屏幕圖像識別模式的尿液有形成分分析儀，才打破了這一局面。經(jīng)過數(shù)次改進和升級，Iris公司于2002年推出小型數(shù)字化的尿液有形成分分析系統(tǒng)iQ－200，并通過連接橋與AX－4280尿干化學(xué)分析儀形成流水線系統(tǒng)（圖1）。自2000年后，國內(nèi)外眾多廠家都開始投入到此類設(shè)備的開發(fā)中，經(jīng)過十余年的發(fā)展，已經(jīng)取得了一定的成績。在我國，這種設(shè)備被稱為數(shù)字圖像自動識別尿液有形成分分析系統(tǒng)，國外也將這類產(chǎn)品稱為流式顆粒影像分析系統(tǒng)。

采用數(shù)字圖像分析技術(shù)，即模擬顯微鏡操作技術(shù)而研發(fā)的設(shè)備，在國內(nèi)市場和國際市場都有良好的發(fā)展。該技術(shù)是以顯微鏡為基本檢測平臺，配合數(shù)字圖像及計算機處理軟件所形成的一類尿液有形成分分析儀器。根據(jù)數(shù)字圖像拍攝方式將其劃分為兩大類，一類為樣本在平板鞘流液輔助下，在樣本不斷的流動過程中拍攝數(shù)字圖像，再經(jīng)計算機軟件系統(tǒng)處理識別的儀器，將其稱為流動拍攝式儀器；另一類是應(yīng)用沉淀技術(shù)將樣本穩(wěn)定的沉淀于特殊的計數(shù)板后，在靜止的狀態(tài)下拍攝數(shù)字照片，再經(jīng)計算機軟件處理和識別的一類儀器，將其稱為靜止拍攝式儀器［1］。

圖1 iQ－200尿液有形成分分析儀及流水線系統(tǒng)

2 檢測原理及流程

2.1 流動拍攝式尿液有形成分分析儀流動拍攝式尿液有形成分分析儀以鞘流液作為媒介，在平板鞘流池中通過時使尿液中的各種成分排成一列，薄層鞘流液將標(biāo)本夾于中心位置并使其處于數(shù)字相機焦點內(nèi)，有形成分的最大平面與攝像鏡頭保持90°垂直，以方便攝像鏡頭拍攝有形成分的最大平面圖像。鞘流液的另一作用是盡量避免發(fā)生重疊，并在頻閃光源的輔助下，在不斷流經(jīng)流動檢測池的過程中拍攝數(shù)字圖像（圖2）。一般每個標(biāo)本會獲取500幅有形成分的數(shù)字圖像，其目的是保證獲取更多有形成分內(nèi)容并保持良好的精密度。

圖2 iQ－200分析系統(tǒng)檢測原理圖

拍攝數(shù)字圖像后，后續(xù)的程序是采用智能化顯微鏡圖像分析技術(shù)和自動粒子識別分析軟件系統(tǒng)，對有形成分進行分類和計數(shù)。目前該設(shè)備可定量分析尿液中的12種有形成分。所拍攝的數(shù)字圖像經(jīng)軟件識別并分類后，以單一成分分類，排列并顯示在屏幕上。操作者可以在顯示器上瀏覽所拍攝的圖像，對儀器自動識別錯誤或不易識別的成分，通過人工在屏幕上重新鑒別、分類和確認(rèn)。儀器的識別軟件一般由生產(chǎn)廠家定期進行升級。采用類似檢測原理的儀器目前還有迪瑞FUS－200型和FUS－100型，并且有相應(yīng)的干化學(xué)分析儀與其配合連接，形成尿液分析工作站。

2.2 靜止拍攝式尿液有形成分分析儀靜止拍攝式尿液有形成分分析儀多以傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡為基本平臺，以固定或一次性計數(shù)板為工具，加裝自動進樣系統(tǒng)、數(shù)字相機和軟件系統(tǒng)為基本構(gòu)成。這類分析設(shè)備的檢測原理和流程基本相近，都是將尿標(biāo)本混勻后充入計數(shù)板，計數(shù)板被固定在帶有XY雙向可移動自動控制的顯微鏡載物平臺上，而所用的計數(shù)板有固定式（包括單通道和多通道）和一次性可棄式兩類。顯微鏡則一般加配100萬或200萬像素的數(shù)字相機。其檢測流程是標(biāo)本通過吸樣針和管道充入計數(shù)板，經(jīng)一定時間的自然沉淀或離心加速沉淀，盡量使得各類有形成分沉淀于計數(shù)板的底部，再由數(shù)字相機通過顯微鏡低倍視野和高倍視野鏡頭拍攝一定數(shù)量的顯微鏡數(shù)字圖像。這些數(shù)字圖像首先由儀器廠家設(shè)計的智能軟件識別程序進行初步鑒別和定量計數(shù)。對儀器不能正確識別或出現(xiàn)錯誤識別的問題，儀器或做報警提示或在屏幕上顯示圖像，最終由有經(jīng)驗的專業(yè)人員通過屏幕識別，對其進行重新確認(rèn)和分類后發(fā)出報告。靜止拍攝式尿液有形成分分析儀檢測流程見圖3。

圖3 靜止拍攝式尿液有形成分分析儀檢測流程

一般情況下軟件中已經(jīng)建立了大量的數(shù)據(jù)模型庫，一般會根據(jù)目標(biāo)大小、邊緣、弧度、長度、顏色、灰度、紋理等各種特征數(shù)據(jù)對圖像進行數(shù)字化處理，通過計算機神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與系統(tǒng)內(nèi)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)模型進行比對、分析、處理、識別。此類儀器的識別軟件可定期升級，通過升級不斷擴充數(shù)據(jù)庫內(nèi)涵和數(shù)據(jù)量，提高軟件識別能力、數(shù)學(xué)模型改進，使其“認(rèn)識”更多成分，會逐步提升尿有形成分的檢出率、識別率和正確率。采用類似原理的儀器國內(nèi)有眾多品牌，如長沙愛威公司的AVE系列儀器，邁瑞（慧生）EH系列儀器，杭州龍鑫公司的LX－8000型，重慶天海THME系列儀器，桂林Urit－1200型等，許多廠家的儀器已經(jīng)進入國外醫(yī)院實驗室。

由于尿液中有形成分的自然沉淀需要一定時間才能拍攝到清晰的數(shù)字圖像，因此影響到儀器的分析速度。為了解決這一瓶頸問題，改進措施一般多為增加檢測計數(shù)池通道，例如最新設(shè)計并推出的Mindray EH－2080型采用了四通道檢測系統(tǒng)，其每小時檢測速度標(biāo)稱為100個樣本，可以滿足大型醫(yī)院的工作量需求（圖4）。

圖4 EH－2080分析系統(tǒng)

而匈牙利E77公司研發(fā)的尿液有形成分分析系統(tǒng)（UriSed，LabUMat，CobioXS，SediMax）產(chǎn)品，則采用一種獨到的一次性計數(shù)板模式，尿液充入計數(shù)板后被轉(zhuǎn)移到一個內(nèi)置微型離心機內(nèi)，將樣本迅速離心10s，達到不濃縮標(biāo)本又快速沉淀的目的（圖5 ）。該儀器的另一特點是可迅速在屏幕上將已經(jīng)識別出的有形成分以文字標(biāo)識出來，給瀏覽者以直觀感覺。靜止拍攝式儀器的一個共同特點是可以在屏幕上顯示最接近顯微鏡下所見到的全視野照片。流動拍攝式和靜止拍攝式尿液有形成分分析儀的特點見圖6。

圖5 計數(shù)板和內(nèi)置微型離心機

圖6 流動拍攝式和靜止拍攝式尿液分析儀的特點

3 優(yōu)勢和特點

由于工作量加大、人員短缺、尿干化學(xué)分析儀的廣泛使用、形態(tài)學(xué)檢驗收費價格的低廉，再加上檢驗科對常規(guī)檢驗項目的重視程度不夠以及人才培養(yǎng)的缺失，使得對尿液有形成分這一傳統(tǒng)、有價值的檢驗項目的要求有所放松，甚至冷落。臨床醫(yī)生往往對缺失尿沉渣檢查結(jié)果的尿液分析報告感到失望，特別是腎臟和泌尿系統(tǒng)科室的臨床醫(yī)師對此有許多不滿。許多檢驗界老專家和有識之士也不斷在呼吁“尿液沉渣檢查不可忽視”。解決這一問題的契機，可能就在于自動化分析設(shè)備的應(yīng)用，而這一進程，我國及國外廠家?guī)缀跬瑫r起步，發(fā)展歷程也只有十余年的時間。

筆者認(rèn)為自動化尿液有形成分分析設(shè)備給臨床實驗室?guī)淼暮锰幹饕幸韵聨c［2］：①實現(xiàn)了自動化操作，檢驗程序標(biāo)準(zhǔn)化、程序化；②提高了復(fù)現(xiàn)性和可比性，不同操作者之間可達到最大的一致性；③節(jié)省人力，提高檢查速度，不同型號的儀器可以適應(yīng)不同用戶的需求；④標(biāo)本無需預(yù)先離心，即刻測定，快速簡捷，全封閉管路系統(tǒng)，盡量減少接觸樣本和防止實驗室污染；⑤數(shù)字圖像的存儲，解決了尿檢驗標(biāo)本不能存留的問題，數(shù)字圖像資料可以作為直接的證據(jù)；⑥將傳統(tǒng)的定性或半定量分析結(jié)果轉(zhuǎn)換為定量分析結(jié)果；⑦開啟尿液有形成分檢查可以實施質(zhì)量控制的方式和路徑；⑧目前此類分析設(shè)備，特別是國內(nèi)廠商的產(chǎn)品所需耗材不多，因此成本相對較低；⑨儀器硬件或軟件不斷改進、訓(xùn)練、擴充數(shù)據(jù)庫，升級，具有逐漸進步、提高識別能力和正確性的能力；⑩所攝數(shù)字圖像可用作培訓(xùn)、科研和資料保存，并可用于發(fā)表文章或圖書出版。筆者預(yù)計今年出版一部《尿液有形成分彩色圖鑒》，首次在圖譜中設(shè)專門章節(jié)，收錄某品牌數(shù)字圖像尿液分析儀拍攝的近百幅尿液有形成分圖片。

4 問題及建議

由于自動化分析技術(shù)在尿液有形成分分析領(lǐng)域的不斷發(fā)展和應(yīng)用，導(dǎo)致一些過度依賴儀器而輕視顯微鏡下形態(tài)學(xué)檢查、不注重復(fù)檢原則、導(dǎo)致漏檢甚至漏診等事件的發(fā)生［3］。叢玉隆教授［4］曾指出：“流式細(xì)胞術(shù)法”和“顯微成像數(shù)字識別法”作為篩選手段，較“干化學(xué)法”有明顯的篩選優(yōu)勢。但對于儀器不能識別或出現(xiàn)“報警”的標(biāo)本，仍需建立并經(jīng)驗證證明切實可行的標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。具有診斷意義的有形成分要鏡檢確認(rèn)，因為對于尿液有形成分檢查而言，規(guī)范的顯微鏡檢查是金標(biāo)準(zhǔn)。就此針對此類儀器的開發(fā)和應(yīng)用，筆者提出一些問題與大家討論。

4.1 識別率雖然尿液有形成分分析儀對具有典型特征的有形成分識別率較高，但由于尿中有形成分種類眾多、亞類眾多、體積大小變化無常、無染色處理、某些成分比較罕見，有形成分還可因保存條件、時間、尿滲透壓、pH等因素改變影響而出現(xiàn)較多的改變，因此對這些成分的識別比較難。儀器應(yīng)該對此類現(xiàn)象提供報警提示功能，提示檢驗審核人員進行細(xì)致辨別和糾正。

4.2 識別內(nèi)容尿液中有形成分一般可分細(xì)胞、管型、結(jié)晶和其他成分共四大類。而各類別還可細(xì)分，例如細(xì)胞可再細(xì)分為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞、移形上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞等十余種；紅細(xì)胞還可分為正常與多種異常形態(tài)，管型和結(jié)晶也可細(xì)分?jǐn)?shù)十個亞類。還有尿液寄生蟲問題目前也得不到正確識別和判斷。因此，尿液有形成分種類眾多，識別難度較大。目前的儀器一般僅能對十余個常見有形成分進行識別，對少見和罕見的成分幾乎不能識別，對許多細(xì)胞、管型和結(jié)晶的亞類也不能準(zhǔn)確劃分。這是一個難點問題，可能需要更長的時間來解決。

4.3 圖像清晰性應(yīng)盡可能采用各種技術(shù)手段拍攝清晰圖像，但目前為止依然不盡如人意。例如所拍攝的數(shù)字圖像可能因為某種成分?jǐn)?shù)量多而發(fā)生重疊或黏連，部分較大的成分位于視野邊緣，或部分位于視野之外。管型等大而厚，細(xì)胞等小而薄，造成自動對焦不準(zhǔn)確，進而造成儀器識別困難。且此類儀器多采用非染色法及黑白灰度數(shù)字照片，對一些有色澤特征的成分表現(xiàn)力度不夠。如果數(shù)字照片不夠清晰，無顏色（而鏡下直接觀看可以看到顏色特征），檢驗審核人員也很難通過屏幕進行再識別。

4.4 質(zhì)量控制實驗室管理要求中對定量檢查項目應(yīng)該有日常質(zhì)量控制程序。而此類設(shè)備國內(nèi)雖然已經(jīng)在使用，但配套的質(zhì)控品尚有欠缺。雖然許多設(shè)備具有質(zhì)控程序，但廠家在研發(fā)配套質(zhì)控物上的態(tài)度不夠積極，而國外產(chǎn)品往往會因價格較高而難以被國內(nèi)用戶接受。穩(wěn)定適用的配套質(zhì)控品，甚至第三方質(zhì)控品對提升儀器檢測和水平至關(guān)重要，對提升實驗室管理水平也具重要價值。而這類分析設(shè)備的室間質(zhì)量評價在我國還是空白。

4.5 方法學(xué)特征性采用類似的檢測原理和方法，使得不少研發(fā)和銷售的儀器缺少特性，缺乏典型的獨創(chuàng)性特點，只能靠拼價格的方式進行銷售，其帶來的后果是后續(xù)服務(wù)、人員培訓(xùn)等跟不上用戶的要求，甚至導(dǎo)致銷售的儀器被擱置，浪費資源。廠家應(yīng)該著力于對產(chǎn)品的深入研究，特別是臨床應(yīng)用性研究，包括支持相關(guān)單位開展的小型科研活動，以證實本產(chǎn)品在臨床應(yīng)用方面的價值。

4.6 生物參考區(qū)間各種原理的尿液有形成分分析系統(tǒng)，在投入臨床應(yīng)用之前應(yīng)該進行參考區(qū)間的確認(rèn)，或?qū)λ玫膮⒖紖^(qū)間進行驗證。只有確定參考區(qū)間才能制定相應(yīng)的篩檢規(guī)則［3］。而參考區(qū)間則需要根據(jù)所用設(shè)備、地區(qū)、性別、年齡和醫(yī)院服務(wù)對象進行確認(rèn)。

4.7 篩檢規(guī)則任何原理的尿液有形成分分析儀都是過篩性檢驗儀器，都應(yīng)該制定相應(yīng)的篩檢規(guī)則?；驹瓌t是應(yīng)配合相應(yīng)的尿干化學(xué)分析系統(tǒng)聯(lián)合制定篩檢規(guī)則。干化學(xué)篩檢項目至少應(yīng)有白細(xì)胞酯酶、血紅蛋白和蛋白質(zhì)三項，當(dāng)其全部陰性且有形成分分析結(jié)果在生物參考區(qū)間內(nèi)的，可以直接審核發(fā)出報告。在生物參考區(qū)間以外的，首先瀏覽數(shù)字圖像，確認(rèn)沒有錯誤識別或漏檢的成分后再進行審核報告。如有錯誤識別或漏識別問題，經(jīng)檢驗專業(yè)人員鑒定并糾正，補充后審核發(fā)出報告。如出現(xiàn)圖像不清晰、重疊等無法識別現(xiàn)象時，可重新測定，或改用傳統(tǒng)顯微鏡檢查確定。如果形態(tài)特殊，建議進一步采用相差顯微鏡或染色等技術(shù)手段確認(rèn)結(jié)果。此外腎臟病、泌尿系統(tǒng)疾病患者及臨床醫(yī)師有特殊要求時，均應(yīng)進行數(shù)字圖像和顯微鏡復(fù)檢［4］。

4.8 性能指標(biāo)在十余年來的發(fā)展中，各生產(chǎn)廠商所開發(fā)的儀器設(shè)備處于完全自由發(fā)展?fàn)顟B(tài)。自2012年起國家食品藥品監(jiān)督管理部門和臨床檢驗實驗室和體外診斷標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會開始制定了《尿液有形成分分析儀（數(shù)字成像自動識別）中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》之后，對儀器研發(fā)、生產(chǎn)、鑒定、評價等做出具體要求。涉及到儀器的技術(shù)性指標(biāo)的內(nèi)容有檢出限，重復(fù)性，攜帶污染率，單項結(jié)果與顯微鏡檢查的符合率、假陰性率、穩(wěn)定性等技術(shù)性要求［5］。這對今后儀器生產(chǎn)和銷售市場也起到規(guī)范化作用，各廠家應(yīng)該嚴(yán)格按照這些標(biāo)準(zhǔn)進行研發(fā)和生產(chǎn)儀器。對醫(yī)院用戶而言，新安裝的儀器也應(yīng)該遵循這些指標(biāo)，對其在實驗室的實際應(yīng)用情況進行系統(tǒng)評價。

5 展望

數(shù)字圖像技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗工作，特別是涉及到形態(tài)學(xué)檢驗的內(nèi)容，目前為止發(fā)展非常迅速，無論在血液學(xué)、體液分析、精液分析、細(xì)胞學(xué)檢查、生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等方面都有不同的應(yīng)用領(lǐng)域。2012年5月法國召開的ISLH會議上，參展商提供了一些與實驗室檢驗相關(guān)的數(shù)字圖像檢驗分析設(shè)備，給參會者以很大啟發(fā)。數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展依賴于計算機技術(shù)的發(fā)展，包括計算機軟件和硬件系統(tǒng)，以及掃描、攝像照相鏡頭等輸入設(shè)備的迅猛發(fā)展，其發(fā)展獲得良好的、廣闊的空間，是一類有發(fā)展前途的產(chǎn)品。

臨床醫(yī)院、科研單位或生產(chǎn)廠家除了專注于尿液常規(guī)的有形成分檢驗內(nèi)容以外，是否考慮增加相差顯微鏡模式以識別異常形態(tài)紅細(xì)胞，進行紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)分類；是否可以添加染色劑，使得在有色條件下更加容易區(qū)分細(xì)胞類別；是否考慮增加高濃度標(biāo)本的自動稀釋功能，因為過高濃度標(biāo)本反而會影響識別準(zhǔn)確性，甚至掩蓋一些其他重要成分；是否可以增加特殊染色程序，以便準(zhǔn)確識別管型以及管型內(nèi)所含的物質(zhì)類型；是否能夠增加體液細(xì)胞常規(guī)分析能力，是否考慮增加對大型細(xì)胞，特別是脫落的腫瘤細(xì)胞進行篩檢和提示能力。其他領(lǐng)域，如涉及到熒光免疫技術(shù)的內(nèi)容，細(xì)胞核酸檢查，抗核抗體檢查、多種細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體檢查、DNA定量細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)等方面，也應(yīng)該有較大的發(fā)展空間。

在電子化、數(shù)字化和計算機化時代，顯微鏡形態(tài)學(xué)數(shù)字化和技術(shù)革命已經(jīng)帶動了形態(tài)學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展，使得形態(tài)學(xué)檢驗診斷技術(shù)從主觀走向客觀，走向標(biāo)準(zhǔn)化和程序化，這是一個革命性的進步，必將獲得更大發(fā)展空間，獲得成功。

1 張時民．實用尿液有形成分分析技術(shù)．第1版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008．

2 張時民．尿有形成分檢查自動化進展和質(zhì)量保證．中國醫(yī)療器械信息，2012，18：13－25．

3 張時民．應(yīng)當(dāng)重視臨床檢驗工作中的形態(tài)學(xué)檢查．實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4：197－201．

4 叢玉隆，馬駿龍，張時民．實用尿液分析技術(shù)與臨床．第1版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013．

5 叢玉隆，顧可粱，金大鳴，等．關(guān)于常規(guī)尿液分析的幾點共識．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35：790－791．

10．3969／j．issn．1674－7151．2014．01．013

2014－01－16）

（本文編輯：李霦）

100730 北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科