趙珍敏，張素華

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

SNP位點(diǎn)作為第三代遺傳標(biāo)記，由于其突變率低，在基因組中分布廣泛等特點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來(lái)越受到法醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分析是判斷該位點(diǎn)是否納入法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的首要工作。進(jìn)行多態(tài)性分析時(shí)，常采用 TaqMan、SNPstream或HRM等方法對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以判斷SNP位點(diǎn)的多態(tài)性。這樣的方法普遍成本高，耗時(shí)多，工作量大。本研究中擬采用pooling技術(shù)建立一組池，采用pyrosequencing這一短片段高精度的測(cè)序技術(shù)，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行等位基因定量分析，從而快速得到其多態(tài)性信息。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

50份健康志愿者的靜脈血樣本，保存于抗凝管中。其中男性25名，女性25名。

1.2 試劑與儀器

QIAamp DNA Mini and Blood Mini試劑盒、PyroMark PCR試劑盒、PyroMark Gold Q96試劑盒、結(jié)合緩沖液、復(fù)性緩沖液、變性緩沖液與洗滌液（德國(guó)Qiagen公司）。鏈霉親和素包被的磁珠（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。引物及生物素標(biāo)記（基康生物公司）。

7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)life公司）；微孔板光度計(jì)（美國(guó)Biotek公司）；單鏈DNA制備純化裝置和焦磷酸測(cè)序儀（德國(guó)Qiagen公司）。

1．3 位點(diǎn)選擇

納入研究的位點(diǎn)分別為：rs220028、rs2074399和rs760087。

1．4 組池構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的組池由上述50名無(wú)關(guān)個(gè)體的DNA樣本組成。采用Investigator Quantiplex定量試劑盒在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行DNA濃度的精確定量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。R2值≥0．990為有效數(shù)據(jù)，樣本DNA測(cè)定濃度必須滿足3次測(cè)定結(jié)果偏差＜5%且樣本濃度不低于40 ng/μL。采用Buffer AE（10 mM Tris·Cl，0．5 mM EDTA，pH 9．0）將每個(gè)樣本濃度稀釋至40 ng/uL，采用微孔板光度計(jì)再次進(jìn)行DNA定量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。要求3次測(cè)定結(jié)果偏差＜5%。將稀釋后的樣本各取1．5 μL，進(jìn)行等量混合，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)用組池。

1．5 引物設(shè)計(jì)

采用PyroMark Assay Design 2．0軟件中的AQ模式進(jìn)行SNP位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)。

1．6 PCR擴(kuò)增與質(zhì)量檢測(cè)

采用PyroMark PCR試劑盒對(duì)組池樣本進(jìn)行上述3個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。具體PCR體系構(gòu)建及擴(kuò)增條件參見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書。對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR產(chǎn)物的質(zhì)量。

1．7 SNP位點(diǎn)的測(cè)序檢測(cè)

取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL，加入40μL結(jié)合緩沖液、1．5 μL 鏈霉親和素包被的磁珠和 18．5 μL 純水，1，400 rpm混勻10 min后，置于70%乙醇、變性緩沖液10s，洗滌液洗滌15s，純化得到標(biāo)記生物素的單鏈DNA。將單鏈DNA模板轉(zhuǎn)入含測(cè)序引物（10 μM）的復(fù)性緩沖液中，80℃雜交3 min，冷卻至室溫。將酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）、底物混合物（底物APS和熒光素）和4種dNTP按PyroMark Q96軟件中規(guī)定的數(shù)目加入相應(yīng)試劑艙中，按所建立的測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。每個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)重復(fù)3次。

1．8 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，3次所得結(jié)果的平均值為該SNP位點(diǎn)的等位基因定量分析結(jié)果；依據(jù)該結(jié)果進(jìn)行法醫(yī)學(xué)參數(shù)的計(jì)算；采用Arlequin對(duì)本次研究所得頻率信息與以往研究中所得頻率信息進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與討論

在制備pooling樣本池時(shí)，最關(guān)鍵的步驟是DNA的等量混勻，混勻的前提在于DNA的精確定量[1-2]。本實(shí)驗(yàn)中主要采用的是Investigator Quantiplex定量試劑盒在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行DNA定量。該試劑盒主要用來(lái)確定樣本是否含有足量DNA以接受DNA指紋圖譜分析等，并確定樣本是否含有可能干擾PCR進(jìn)行的抑制劑。抑制劑的檢測(cè)主要是將DNA標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參CT值和未知樣本內(nèi)參CT值進(jìn)行比較，其中內(nèi)參陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)生的CT值約為31。與標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本相比，可能出現(xiàn)內(nèi)參CT值有±1范圍的波動(dòng)。對(duì)于DNA濃度＜40ng/uL或者含有PCR抑制劑的樣本進(jìn)行DNA重新提取，滿足要求后將其進(jìn)一步稀釋至40 ng/uL，再次定量，從而保證定量的準(zhǔn)確性及后續(xù)PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行。

采用 PyroMark Assay Design 2．0軟件進(jìn)行 SNP位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)的信息見(jiàn)表1。pyrosequencing技術(shù)在進(jìn)行DNA序列分析時(shí)不需要電泳和熒光標(biāo)記，可以直接測(cè)定引物后面的堿基序列，定量性能好，結(jié)果準(zhǔn)確，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，是一種實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)。檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與聚合的dNTP個(gè)數(shù)成正比，根據(jù)加入的dNTP類型和熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。對(duì)50份DNA樣本所構(gòu)成的組池樣本采用pyrosequencing技術(shù)在3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行等位基因定量分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)Arlequin軟件統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)[3]中所報(bào)道的rs220028位點(diǎn)頻率數(shù)據(jù)信息無(wú)顯著性差異（p＞0．05）。

表1 SNP位點(diǎn)進(jìn)行等位基因定量分析的引物信息

表2 SNP位點(diǎn)的等位基因頻率分布及法醫(yī)學(xué)參數(shù)

本次研究中所選擇的3個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布好，多態(tài)性好，可滿足法醫(yī)遺傳學(xué)遺傳標(biāo)記應(yīng)用要求。其次，Pyrosequencing技術(shù)結(jié)合pooling方法用于等位基因定量檢測(cè)的技術(shù)準(zhǔn)確可靠，方便快捷，可以快速得到SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息，適用于位點(diǎn)的初篩及大規(guī)模頻調(diào)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳逸飛，鐘詩(shī)龍，羅建方，等．基于DNA pooling技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)研究篩選主動(dòng)脈夾層等位基因遺傳位點(diǎn)[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（20）：3405-3407．

[2]Men T， Zhang X， Yang J， et al．The rs1050450 C＞T polymorphism of GPX1 is associated with the risk of bladder but not prostate cancer： evidence from a meta-analysis[J]．Tumour Biol．2013．

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