康愛建 李雙雙 顧紅兵

【摘要】目的：研究含益生元的嬰兒配方奶對腸道菌群和雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的影響。方法：以健康足月剖宮娩出嬰兒為研究對象，含益生元配方組（實驗組）、標(biāo)準(zhǔn)配方組（對照組）、母乳喂養(yǎng)組（母乳組）各50例。在嬰兒42天、3月時采集糞便標(biāo)本，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對腸道梭菌、大腸桿菌、雙歧桿菌及雙歧桿菌某些重要亞種如長雙歧桿菌等，進行定量檢測。結(jié)果：嬰兒42天時，三組腸道菌群及雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）；3月時，實驗組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例比對照組低（P <0.05），且更接近母乳喂養(yǎng)組；同時實驗組雙歧桿菌比例、長雙歧桿菌及短雙歧桿菌數(shù)量均比對照組高（P <0.05），且更接近母乳喂養(yǎng)組。結(jié)論：3月內(nèi)隨著月齡生長，使用含益生元配方奶健康嬰兒的腸道菌群及雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的改變逐漸接近于母乳喂養(yǎng)嬰兒。

【關(guān)鍵詞】益生元 嬰兒 腸道菌群 雙歧桿菌

【中圖分類號】R4 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1671-8801（2014）10-0006-02

母乳喂養(yǎng)是嬰兒獲得以雙歧桿菌為主導(dǎo)的腸道菌群，增強免疫功能和抗感染能力的最佳選擇。母乳中的某些成分如低聚糖，對于正常腸道菌群建立的作用至關(guān)重要。由于自身體質(zhì)、環(huán)境、工作等因素，很多母親無法哺乳，嬰兒配方乳是這些嬰兒的唯一選擇。本研究對使用添加益生元的配方奶健康足月嬰兒前三個月腸道雙歧桿菌種群進行定量分析，以觀察配方奶對腸道菌群和雙歧桿菌種群結(jié)構(gòu)的可能影響，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2010年7月至2011年12月我院產(chǎn)科剖宮娩出的150例健康的足月嬰兒，自愿人工喂養(yǎng)100例及純母乳喂養(yǎng)50例為觀察對象，連續(xù)觀察其生后三月內(nèi)腸道雙歧桿菌的定植發(fā)展過程并對其菌種組成進行定量分析。入選標(biāo)準(zhǔn)：健康足月剖宮產(chǎn)娩出嬰兒（≥37孕周），出生體重2500～4000g。 排除標(biāo)準(zhǔn)：嬰兒或其父母有任何明顯的代謝性疾??；先天異常/出生缺陷；進入研究前患有感染性疾病，使用過抗生素、益生元或益生菌制劑。所有嬰兒出生后都建議母乳喂養(yǎng)，不能堅持母乳喂養(yǎng)的嬰兒（生后2周內(nèi)自愿從母乳喂養(yǎng)轉(zhuǎn)為奶粉喂養(yǎng)的嬰兒），隨機選擇分為實驗組（50例）： 將被提供添加益生元的配方奶粉（精裝優(yōu)階貝護，多美滋公司）并持續(xù)使用直到3個月齡。 對照組：提供標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉（多美滋公司）。母乳喂養(yǎng)組： 生后2周內(nèi)開始純母乳喂養(yǎng)的嬰兒，將被錄入研究并被指定入母乳喂養(yǎng)組。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

3組研究對象嬰兒分別在生后42天、3個月時采集糞便樣本，采樣后立即置入無菌大便杯，途中使用干冰保存運輸，轉(zhuǎn)入實驗室于一80℃冰箱保存，直至糞便細(xì)菌DNA抽提。

1.2.2 標(biāo)本細(xì)菌DNA的抽取

使用 QIAamp DNA stool Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany）抽提樣品糞便內(nèi)細(xì)菌基因組DNA，抽提后的DNA溶液在定量分析前凍存于一80℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 PCR引物及探針設(shè)計與合成

依據(jù)各細(xì)菌16SrRNA及16S-23SrRNA序列特異性基因序列，設(shè)計合成乳酸桿菌和雙

歧桿菌種特異性引物和探針，并在BLAST基因庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）內(nèi)比對引物和探針的特異性，引物及探針由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR

雙歧桿菌和乳酸桿菌的定量檢測采用SYBR Green I熒光染料法。擴增條件：95℃預(yù)變性10s后，各細(xì)菌循環(huán)（雙歧桿菌參數(shù)為：95℃變性10s，-60℃退火10s，-72℃延伸1min；乳酸桿菌參數(shù)為：95℃變性10s，-56℃退火10s，-72℃延伸1min），各40個循環(huán)。

雙歧桿菌亞種的定量檢測采用TaqMan水解探針法。長雙歧桿菌和短雙歧桿菌擴增條件：95℃預(yù)變性10s，95℃變性10s，-57℃退火10s，-72℃延伸20s，各45個循環(huán)；青春雙歧桿菌擴增條件：95℃預(yù)變性10s，95℃變性10s，-58℃退火10s，-72℃延伸20s，45個循環(huán)。所有Real-time quantitative PCR反應(yīng)于LightCycle 480（Roche）上進行。每次實驗都設(shè)陰性對照，每個樣本做3個平行復(fù)孔。取確定量的細(xì)菌DNA（雙歧桿菌、乳酸桿菌和長雙歧桿菌由上海交通大學(xué)生物醫(yī)藥研究所提供，短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌購于中國科學(xué)院微生物研究所）10倍梯度稀釋后同時進行PCR反應(yīng)，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，采用t檢驗；P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組嬰兒腸道菌群生長情況

第42天時三組嬰兒腸道菌群生長比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。第3月時，實驗組雙歧桿菌比例明顯高于對照組，且第3月時實驗組雙歧桿菌比例更接近母乳喂養(yǎng)組；實驗組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例均比對照組低，且更接近母乳喂養(yǎng)組。（* P <0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義）。見表1.

2.2 三組嬰兒雙歧桿菌菌種定量檢測結(jié)果

雙歧桿菌種群中長雙歧桿菌檢出率較高，短雙歧桿菌檢出率相對較低，而青春雙歧桿菌檢出率更低（僅母乳組檢出1例）。實驗第42天時，長雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長數(shù)量均表現(xiàn)為：母乳組>實驗組>對照組，實驗組、對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）；實驗第3月時，長雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長數(shù)量均表現(xiàn)為：實驗組> 母乳組>對照組，實驗組、對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見表2.

3 討論

嬰兒期是腸道菌群快速演替的重要階段，腸道菌群在維持人體健康方面起到重要作用，如提供生物屏障、影響營養(yǎng)代謝功能、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)等。雙歧桿菌為主導(dǎo)的腸道菌群為嬰幼兒的腸道健康提供了獨特的保護作用，有效地減少嬰幼兒腸道、呼吸道感染的發(fā)病率。新生兒剛出生時腸道是無菌的，出生后腸道立即被來自母體和周圍環(huán)境中的微生物定植[1]。第一個影響嬰兒腸道菌群的因素為分娩方式[2]，而生后直至斷乳期，喂養(yǎng)方式是影響菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的最重要因素，母乳喂養(yǎng)可促進嬰兒腸道雙歧桿菌形成。本研究以剖宮產(chǎn)娩出的嬰兒為研究對象，排除了分娩方式對嬰兒腸道菌群的影響因素。

研究結(jié)果顯示第3月時，實驗組雙歧桿菌比例明顯高于標(biāo)準(zhǔn)配方組，且實驗組雙歧桿菌比例更接近母乳喂養(yǎng)組；實驗第3月時，實驗組有害菌群梭菌和大腸桿菌的比例均明顯比對照組低，且更接近母乳喂養(yǎng)組。提示含益生元配方奶喂養(yǎng)能促進嬰兒以雙歧桿菌占優(yōu)勢的腸道有益菌群的形成，且抑制腸道有害菌群生長，有助于提高嬰兒腸道免疫功能，避免了多種感染發(fā)生[3]。添加益生元配方奶對嬰兒腸道菌群的影響與母乳有著異曲同工的作用。

喂養(yǎng)方式對腸道雙歧桿菌種群的多樣性也具有重要影響。國內(nèi)外研究報道，正常健康嬰兒腸道雙歧桿菌的優(yōu)勢菌種主要為長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌及鏈狀雙歧桿菌等[4，5]，青春雙歧桿菌在過敏嬰兒腸道菌群中較為常見[6，7]。但不同人種、分娩方式、喂養(yǎng)方式、檢測方法所得出的結(jié)果有差異，故目前尚無定論。本研究顯示，三組雙歧桿菌種群中長雙歧桿菌檢出率較高，短雙歧桿菌檢出率相對較低， 實驗第42天時，三組長雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而實驗第3月時，長雙歧桿菌及短雙歧桿菌生長數(shù)量均表現(xiàn)為：實驗組> 母乳組>對照組，實驗組、對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。僅1例母乳喂養(yǎng)嬰兒檢出青春雙歧桿菌，提示青春雙歧桿菌為嬰兒腸道雙歧桿菌非優(yōu)勢菌種。叢所周知，青春雙歧桿菌為成人腸道中雙歧桿菌的優(yōu)勢菌種，使用PCR法也可自母乳中檢測出青春雙歧桿菌[8]，推測母乳喂養(yǎng)嬰兒可能自母親皮膚接觸或母乳中獲得青春雙歧桿菌。近年來研究表明，小兒的慢性腸道炎癥及特異性疾病與其腸道內(nèi)雙歧桿菌種群構(gòu)成變化有關(guān)[9-10]。因此，研究正常嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌種群及其之間的比例，對我們了解和改善腸道菌群至關(guān)重要。但本研究樣本量偏小，研究結(jié)果仍有一定的局限性。希望在以后的研究中采用更大的樣本，引進更為可靠的研究方法進一步加以明確。

母乳中除了乳糖，含量最為豐富的即為低聚糖成分，目前已檢測出130多種低聚糖成分，是最佳的天然雙歧因子。隨著配方奶不斷改良，標(biāo)準(zhǔn)配方奶喂養(yǎng)嬰兒體格發(fā)育方面與母乳喂養(yǎng)嬰兒無明顯差異，但其腸道菌群的形成與母乳有很大差別。本研究提示添加益生元配方奶對嬰兒腸道菌群及雙歧桿菌菌種結(jié)構(gòu)的影響與母乳有著相似的作用，亦能促進嬰兒腸道雙歧桿菌形成，阻止病原微生物腸道內(nèi)定植，預(yù)防腹瀉及腸道感染，緩解便秘，增強免疫功能，減少過敏的發(fā)生。

總之，本研究結(jié)果提示，母乳是嬰兒最好的天然食品，添加益生元配方奶對嬰兒腸道雙歧桿菌誘發(fā)有著類母乳化作用，是人工喂養(yǎng)嬰兒良好的食品來源。

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通訊作者：顧紅兵

注：南通大學(xué)自然科學(xué)項目[10Z094]