閆洪波等

摘要 [目的]研究偏腫革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表達(dá)情況。[方法]根據(jù)白腐菌錳過(guò)氧化物酶（MnP）基因保守序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR、RACE及染色體步移等方法，克隆偏腫革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全長(zhǎng)MnP1基因（GenBank登錄號(hào)JQ327834 ），進(jìn)行蛋白序列分析，并通過(guò)雙酶切的方法獲得重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。[結(jié)果]獲得偏腫革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全長(zhǎng)MnP1基因，命名為L(zhǎng)gmnp1。蛋白序列分析表明LgMnP1含有4個(gè)二硫鍵屬于短MnP，預(yù)測(cè)成熟蛋白分子量為35.94 kD，pI為4.43。通過(guò)雙酶切的方法將Lgmnp1的開(kāi)放閱讀框（ORF）序列連接到pPICZB載體上，獲得重組質(zhì)粒pPICZB/Lgmnp1，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后，在BMMY培養(yǎng)基中甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，在未添加血紅素的培養(yǎng)液中MnP胞外酶活在72 h達(dá)到最高為7 U/L，表明Lgmnp1已被轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中并可誘導(dǎo)表達(dá)。[結(jié)論]該方法對(duì)偏腫革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表達(dá)情況進(jìn)行研究，為偏腫革裥菌Lgmnp1基因的進(jìn)一步應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 偏腫革裥菌；錳過(guò)氧化物酶；基因克?。划叧嘟湍?；基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào) S718.81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03186-05

Abstract [Objective] To study cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa. [Method] A full length DNA gene Lgmnp1 encoding for an isoenzyme of manganese peroxidase （MnP） from Lenzites gibbosa stain CB1 （GenBank accession No. JQ327834） was cloned by the methods of PCR， RACE， and Genome Walking PCR with primers designed based on the conserved sequences of the known MnP genes from other whiterot fungi and amplified DNA fragments. [Result] Protein sequence analysis showed that LgMnP1 belonged to short MnP due to its 4 disulfide bonds. The predicted molecular mass of mature LgMnP1 was 35.94 kDa， and the pI was 4.43. The full open reading frame（ORF） sequence of Lgmnp1 was cloned by restriction enzyme digestion primers. The recombinant plasmid pPICZB/Lgmnp1 was constructed by ligating the ORF sequence and the expression plasmid pPICZB both digested by the restriction enzyme EcoRI and XbaI. Then the pPICZB/Lgmnp1 was transformed into P. pastoris by electroporation. After verified by PCR， two transformant Pichia strains were cultured in BMMY medium and induced by anhydrous methanol added at each 24 h， and their MnP activities were determined during 96 h. Results showed that the transformant strain 1 could produce MnP activity in the absence of heme， and the highest MnP activity in the culture supernatant was 7 U/L after 72 h incubation， indicating that the gene Lgmnp1 had been effectively transformed into the recombinant Pichia pastoris SMD1168HLgmnp1 and expressed in inductive environment. [Conclusion] The cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa was studied， which will provide a reference for further application of Lgmnp1 gene.

Key words Lenzites gibbosa； Manganese peroxidase（MnP）； Gene cloning； Pichia pastoris； Gene expression

木質(zhì)素是苯丙烷類(lèi)結(jié)構(gòu)單元之間以醚鍵和碳碳鍵相連接的一類(lèi)復(fù)雜的天然芳香族高聚物，與其他生物高分子如纖維素等明顯不同，不含易水解的重復(fù)單元，因而不受水解酶的控制，其生物降解機(jī)制是氧化作用；其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且含有較多的在生物學(xué)上穩(wěn)定的鍵型，性狀穩(wěn)定，難以為一般的微生物所分解。能夠引起木質(zhì)素強(qiáng)烈分解的只有木材白腐菌（White rot fungi），而木材褐腐菌、細(xì)菌及放線菌一般只能部分地改變木質(zhì)素分子的結(jié)構(gòu)，或?qū)⒁驯话赘到獾揭欢ǔ潭鹊哪举|(zhì)素及其斷裂的芳香化合物進(jìn)一步加以分解。由于白腐菌能夠有效地降解木質(zhì)素，及廢水和土壤中難被降解的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、DDT、染料、炸藥及疊氮化合物等有毒物質(zhì)。因此，研究白腐菌的酶學(xué)及其基因?qū)W具有重要的應(yīng)用意義。白腐菌產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶主要包括錳過(guò)氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP）、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）和漆酶（laccase）等。一些白腐菌產(chǎn)生上述這3種分解木質(zhì)素的酶，而大多數(shù)白腐菌僅產(chǎn)生2種甚至1種分解木質(zhì)素的酶，表明這3種酶在分解木質(zhì)素的過(guò)程中并不是全都必需的。MnPs（EC 1.11.1.13）是一種依賴H2O2的含F(xiàn)e3+和血紅素輔基的糖基化細(xì)胞外過(guò)氧化物酶，廣泛存在于白腐菌中，到目前為止在其他微生物中并未發(fā)現(xiàn)有MnP的相關(guān)報(bào)道。MnP可氧化木質(zhì)素中的酚類(lèi)和非酚類(lèi)的結(jié)構(gòu)單元。

基因克隆與表達(dá)是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于基因研究的一個(gè)主要技術(shù)手段[1]。國(guó)外目前已經(jīng)被克隆的MnP同工酶基因主要有：黃包原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的mnp1、mnp2、mnp3和mnp4[2]，蟲(chóng)擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）的mnp1、mnp2A、mnp2B、mnp3和mnp4[3]，云芝（Trametes versicolor）的mnp1和mnp2[4]，射脈菌（Phlebia radiata）的mnp1、mnp2和mnp3[5]，香菇（Lentinula edodes）的mnp1[6]，地中海擬層孔菌（Fomitiporia mediterranea）的mnp1、mnp2和mnp3[7]等。但國(guó)內(nèi)對(duì)MnP同工酶基因的研究還較少。偏腫革裥菌（Lenzites gibbosa）是一種對(duì)木材和木質(zhì)素分解能力較強(qiáng)的白腐菌，對(duì)該種MnP基因的研究國(guó)內(nèi)外尚屬空白。筆者在完成該菌株一個(gè)編碼MnP蛋白基因Lgmnp1克隆的基礎(chǔ)上，將該mnp基因轉(zhuǎn)化到了畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，以期為以后該類(lèi)基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris SMD1168H及酵母表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZB，購(gòu)自Invitrogen公司；偏腫革裥菌L.gibbosa菌株CB1，自長(zhǎng)白山采集并分離，菌種保藏于東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲(chóng)病理實(shí)驗(yàn)室。YPD平板培養(yǎng)基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白胨；2%（W/V）葡萄糖；2%（W/V）瓊脂粉；100 μg/ml Zeocin。產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基（LNAS，Low Nitrogen Asparagine Succinic acid）[8]。BMGY/BMMY培養(yǎng)基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白陳：100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）；1.34% YNB；4×10-5%生物素；1%甘油/1%甲醇。

1.2 Lgmnp1 基因克隆

1.2.1 Lgmnp1 基因DNA片段的擴(kuò)增。離心收集生長(zhǎng)在2.000 g青楊（Populus ussuriensis）木屑為產(chǎn)酶底物的LNAS培養(yǎng)液內(nèi)9～13 d的菌絲[9]，液氮凍存?zhèn)溆?。使用TIANGEN公司的DNAquick快捷型植物基因組DNA試劑盒提取所收集菌絲的基因組DNA。 根據(jù)白腐菌MnP基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物1F、1R（表1），以L.gibbosa基因組DNA為模板，擴(kuò)增Lgmnp基因的DNA片段。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。具有目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)，確認(rèn)與MnP同源后，根據(jù)該序列外顯子部分設(shè)計(jì)RACE引物。

1.2.2 Lgmnp1全長(zhǎng)DNA基因的擴(kuò)增。用OMEGA公司的E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒及相關(guān)方法提取總RNA。根據(jù)“1.2.1”中獲得的DNA序列外顯子部分設(shè)計(jì)了一條5′RACE引物（表1），使用Clontech 的SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行5′RACE反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)5′ RACE獲得的cDNA片段，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性基因組上下游引物DNAup和DNAdown，以L.gibbosa基因組DNA為模板，擴(kuò)增該引物對(duì)范圍內(nèi)的DNA序列。根據(jù)該DNA序列設(shè)計(jì)5′和3′端walking PCR 引物，其5′上游序列的擴(kuò)增見(jiàn)[10]，兩輪3′端引物見(jiàn)表1，用TaKaRa公司的染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit）及相關(guān)方法進(jìn)行基因組序列擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)要求、PCR的反應(yīng)體系、擴(kuò)增的溫度條件和循環(huán)數(shù)等見(jiàn)（http：//www.takara.com.cn/？action=Page&Plat=pdetail&newsid=289&subclass=1）。擴(kuò)增完畢后，取第2、3輪PCR反應(yīng)液各2 μl，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察電泳圖確定目的條帶。對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)、拼接，獲得全長(zhǎng)DNA基因。通過(guò)NCBI的ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /projects/gorf/）查找該基因的讀碼框ORF，分析起始密碼子，終止密碼子，以及5′ 非翻譯區(qū)和3′ 非翻譯區(qū)等信息。使用BioEdit分析軟件對(duì) cDNA核苷酸序列進(jìn)行堿基成分分析，將cDNA核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行分析。使用NCBI的BLAST和Conserved Domain Database（CDD）軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白序列的基本信息、保守結(jié)構(gòu)域。采用Signal Scan（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/signal/）和SignalP 4.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽。

1.3 Lgmnp1在畢赤酵母中的表達(dá)

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證。以“1.2.2”中5′RACE中RTPCR獲得的cDNA第一鏈為模板，用上游引物BDF：5′CGGAATTCATGGCGTTCAAGCTACTC 3′，下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)；和下游引物BDR：5′GCTCTAGATTAGGACGGGGGGACGGG 3′，下劃線為XbaI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增Lgmnp1完整編碼序列（coding sequence，CDS）。將Lgmnp1完整CDS與表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZB分別用EcoRI和XbaI雙酶切，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZB/Lgmnp1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用雙酶切引物BDF和BDF進(jìn)行PCR驗(yàn)證，及用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。對(duì)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒用AOX通用引物進(jìn)行測(cè)序和堿基突變分析。

1.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及轉(zhuǎn)化子的MnP活性檢測(cè)。對(duì)含重組質(zhì)粒的Top10陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)BamH I單酶切將其線性化，電轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母P.pastoris 的感受態(tài)細(xì)胞中。用含有Zeocin的YAD平板進(jìn)行篩選，獲得的轉(zhuǎn)化子用AOX通用引物及引物BDF和BDR進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子菌株接種到BMGY培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（30 ℃，280 r/min）至OD600在2～6，離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基中至OD600=1，每24 h加入無(wú)水甲醇至終濃度0.5%。由于血紅素是MnP在酵母中表達(dá)的限制性因素，因此設(shè)置2組試驗(yàn)，分別為不添加和添加血紅素，添加血紅素的終濃度為500 mg/L[10]。在0～96 h內(nèi)每隔12 h提取菌液進(jìn)行酵母生長(zhǎng)量（以O(shè)D600作為酵母的相對(duì)生長(zhǎng)量）和MnP活性檢測(cè)，酶活檢測(cè)方法同[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lgmnp1全長(zhǎng)基因的克隆結(jié)果 首先，以L.gibbosa DNA為模板，用引物1F和1R擴(kuò)增到一個(gè)400 bp目的基因片段。將該序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與T.versicolor的MnP序列具有較高同源性，為83%，因此確定該序列為L(zhǎng).gibbosa的MnP基因片段。其次，通過(guò)5′ RACE PCR擴(kuò)增得到約500 bp目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示該序列中包含5′ RACE接頭引物和特異性引物5′ race GSP。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該5′ RACE片段與T.versicolor的MnP序列同源性可達(dá)82%。但該序列與最初獲得的MnP基因400 bp片段序列差異較大，無(wú)法拼接。這一結(jié)果是由于白腐真菌中存在MnP基因家族，且不同的MnP基因之間存在較高的相似性。于是，試驗(yàn)將該5′ RACE片段命名為L(zhǎng)gmnp1。根據(jù)基因組特異性上下游引物DNAup和DNAdown獲得415 bp DNA片段，序列比對(duì)表明該片段與5′ RACE獲得的基因片段具有重疊區(qū)域，為L(zhǎng)gmnp1的DNA序列。5′上游walking PCR的結(jié)果見(jiàn)[10]。為了獲得該Lgmnp1基因的3′端序列，試驗(yàn)繼續(xù)利用walking PCR方法。第1輪PCR擴(kuò)增獲得3′端1 014 bp的序列，該序列與415 bp DNA片段有334 bp重疊區(qū)域，第2輪3′端PCR擴(kuò)增得到2 292 bp目的DNA序列，該序列與walking PCR第1輪序列有318 bp的重疊區(qū)域，這一結(jié)果表明所得序列即為L(zhǎng)gmnp1下游3′端序列。通過(guò)序列拼接得到完整的Lgmnp1 DNA序列，GenBank登錄號(hào)為JQ327834。并比對(duì)出完整的cDNA基因，登錄號(hào)分別為FJ848739。

序列結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明，基因Lgmnp1的DNA全長(zhǎng)4 595 bp，含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)13～340 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)56～68 bp；其cDNA基因含有49 bp的5′UTR及129 bp的3′UTR序列，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 095 bp。從ATG到TAA的cDNA序列GC含量占65%，而DNA序列由于加入了內(nèi)含子導(dǎo)致了GC含量下降了3.2%。在cDNA水平上Lgmnp1與T.versicolor的mnp、mnp2、cmp5和cmp3基因（GenBank登錄號(hào)分別為AJ745879、AF102515、AY677131、AY677130）覆蓋率為100%，其相似性最高為82%～83%。

2.2 推定的偏腫革裥菌錳過(guò)氧化物酶1（LgMnP1）的特征 LgMnp1基因編碼364個(gè)氨基酸（amino acid，aa）的蛋白質(zhì)多肽前體（GenBank登錄號(hào)：ACO92620），包含了一個(gè)21aa的信號(hào)肽及5aa的前導(dǎo)短肽。LgMnP1成熟蛋白長(zhǎng)度為338 aa，預(yù)測(cè)成熟蛋白分子量為35.94 kD，pI為4.43，帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）有43個(gè)，帶正電荷殘基（Arg+Lys+His）有30個(gè)，總原子數(shù)為4 979個(gè)，分子式為C1588H2447N433O501S10。其催化結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的氨基酸殘基與其他白腐菌的MnP類(lèi)似，都具有保守性。主要包括：①3個(gè)與血紅素連接的氨基酸R43、H47和H176。②3個(gè)與Mn2+連接的氨基酸E36、E40和D182。③5個(gè)與血紅素近側(cè)末端的Ca2+連接的氨基酸 T177、D194、T196、E198和D201，4個(gè)與遠(yuǎn)側(cè)末端的Ca2+連接的氨基酸D48、G66、D68和S70。④構(gòu)成4個(gè)二硫橋的8個(gè)半胱氨酸殘基C3∶C15、C14∶C285、C34∶C120和C249∶C314。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，Lgmnp1與T.versicolor的MnP（CAG33918）同源性最高為88%，與Polyporus brumalis的MnP3蛋白（AEJ37996）同源性為86%。Lgmnp1由于含有4個(gè)二硫鍵，可將其歸入短MnPs類(lèi)群。

2.3 Lgmnp1基因的完整CDS擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增獲得約1.1 kb的特異性目的條帶，見(jiàn)圖1A。凝膠回收該片段，加A尾處理后與T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選出5個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果有3個(gè)轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證正確，見(jiàn)圖1B中的3、5、7泳道。將這3個(gè)單克隆的培養(yǎng)菌液進(jìn)行測(cè)序，與Lgmnp1的ORF序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果序列比對(duì)結(jié)果完全一致，未發(fā)生堿基突變。

2.4 重組質(zhì)粒pPICZB/Lgmnp1的驗(yàn)證 通過(guò)引物BDF和BDR對(duì)重組質(zhì)粒pPICZB/Lg mnp1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示在1.1 kb處產(chǎn)生清晰特異性條帶，與CDS序列大小一致，見(jiàn)圖1C；用EcoRI和XbaI雙酶切后在1.1和3.3 kb處產(chǎn)生2條清晰特異性條帶，1.1 kb處為目的CDS條帶，3.3 kb處為pPICZB載體條帶，見(jiàn)圖1D。對(duì)重組質(zhì)粒用AOX通用引物測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列未有堿基發(fā)生突變。以上結(jié)果說(shuō)明Lgmnp1的完整CDS序列已經(jīng)連入pPICZB載體中，重組質(zhì)粒pPICZB/Lgmnp1構(gòu)建成功。

2.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)化后在篩選平板上生長(zhǎng)的酵母菌株分別命名為1、2和3號(hào)菌株，用AOX通用引物和引物BDF和BDR進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1E。其中2～4泳道為引物BDF和BDR的PCR擴(kuò)增結(jié)果，5～7泳道為AOX通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果。引物BDF和BDR的PCR擴(kuò)增結(jié)果中僅第2泳道的1號(hào)菌株在1.1 kb處有一條較為模糊的目的條帶；AOX通用引物PCR擴(kuò)增的第5、7泳道的1和3號(hào)菌株各自顯示2條帶，其中1.3 kb條帶為目的基因與約200 bp的pPICZB載體序列，2.1 kb條帶為AOX1基因條帶。該結(jié)果表明pPICZB/Lgmnp1重組質(zhì)粒已被整合到畢赤酵母菌株中。因此，繼續(xù)用1和3號(hào)菌株進(jìn)行MnP的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)量的測(cè)定和重組MnP的誘導(dǎo)表達(dá) 畢赤酵母在MM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量通過(guò)測(cè)定600 nm處的吸光度值OD600來(lái)確定。如圖2A所示，重組酵母菌株的生物量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)不斷增加，菌株1和3的生長(zhǎng)速度幾乎相同，但添加血紅素處理菌株明顯比未處理菌株生長(zhǎng)要慢，如圖2B所示。3號(hào)菌株在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)論是否添加血紅素都未檢測(cè)到MnP酶活；而菌株1在未加入血紅素的培養(yǎng)基中，在48 h出現(xiàn)MnP的酶活性，72 h達(dá)到最大酶活力為7 U/L，96 h幾乎下降為0，說(shuō)明Lgmnp1已經(jīng)有效地被轉(zhuǎn)化到了畢赤酵母菌株中，并在甲醇誘導(dǎo)下得到表達(dá)。但該菌株在添加了血紅素的培養(yǎng)基中反而未檢測(cè)到MnP的活性變化。

3 結(jié)論與討論

為了有效地探討白腐菌錳過(guò)氧化物酶MnP基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理，有必要進(jìn)行該基因的轉(zhuǎn)化與表達(dá)研究。編碼白腐菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)的基因已經(jīng)在幾種宿主細(xì)胞中得到表達(dá)，主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）[9]及構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）等絲狀真菌。目前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過(guò)（E.coli）表達(dá)的，其主要優(yōu)點(diǎn)是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但由于其是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，其產(chǎn)物往住形成沒(méi)有活性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等處理才能應(yīng)用。如MnP基因在E.coli中的表達(dá)產(chǎn)物既為無(wú)血紅素插入的、無(wú)酶活性的包涵體。近年來(lái)以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益受到重視和利用，原因是酵母是一種單細(xì)胞真核生物，其不僅具有易培養(yǎng)、繁殖快、遺傳操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，還具有真核生物表達(dá)時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、修飾、合理的空間折疊等功能，有利于真核基因的表達(dá)。P.pastoris是甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，是經(jīng)過(guò)改進(jìn)的第2代整合型表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)載體包含乙醇氧化酶1（AOX1）基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子（5′AOX1和3′AOX1），它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開(kāi)，外源基因可以在此插入。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體酵母時(shí)，其5′AOX1和3′AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個(gè)載體連同外源基因插入到酵母染色體上，形成穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系，外源基因在5′AOX1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。P.pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。試驗(yàn)首先采用PCR、RACE及染色體步移等方法，克隆了偏腫革裥菌L.gibbosa菌株CB1的MnP1全長(zhǎng)基因Lgmnp1和完整CDS基因，在對(duì)該基因與蛋白序列進(jìn)行了基本生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，將其CDS基因整合到重組質(zhì)粒pPICZB/Lgmnp1并轉(zhuǎn)化到了P.pastoris的基因組中，使該基因在甲醇誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。

由于白腐菌分泌的MnPs在自然狀態(tài)下是高度螺旋的含血紅素的五聚物糖蛋白，所以MnPs蛋白翻譯后血紅素的加入是修飾的必有環(huán)節(jié)。關(guān)于MnP在P.pastoris中異源表達(dá)的報(bào)道，例如黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）的mnp2基因在P.pastoris中得到成功表達(dá)，提及到血紅素對(duì)其活性的影響很大[9]，P.chrysosporium的MnP1基因也已經(jīng)在A.oryzae中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，但血紅素仍為MnP酶活的限制性因素[11]。在這些文獻(xiàn)中提及了血紅素的終濃度為500 mg/L，配制方法使用0.1～1.0 mol/L的NaOH溶液，因此試驗(yàn)也嘗試用血紅素來(lái)提高重組MnP的表達(dá)活性，選擇了用0.1 mol/L NaOH配置血紅素溶液，所用濃度為500 mg/L，但卻未能夠檢測(cè)到MnP的活性。分析原因一種可能是由于血紅素只溶于弱堿性環(huán)境，添加堿性的血紅素溶液后酵母生長(zhǎng)環(huán)境的pH值發(fā)生了變化，改變了酵母的最適生長(zhǎng)環(huán)境，這對(duì)酵母的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，而這可能也阻礙了酵母轉(zhuǎn)化子對(duì)MnP的分泌和表達(dá)。添加血紅素后生物量的確下降了，這點(diǎn)從圖2A中可觀察到。第2種可能是由于血紅素的濃度過(guò)高，500 mg/L不是適宜的濃度，今后還需要通過(guò)梯度篩選對(duì)血紅素的用量進(jìn)一步摸索，同時(shí)對(duì)添加方式、時(shí)間等條件進(jìn)一步測(cè)試。

試驗(yàn)獲得重組MnP的酶活較低，雖然酵母轉(zhuǎn)化子比本體菌株表現(xiàn)出MnP的活性時(shí)間提前了2～3 d，這一結(jié)果與相關(guān)報(bào)道類(lèi)似[9]。因此無(wú)法進(jìn)行蛋白純化及相關(guān)的酶學(xué)分析等后續(xù)試驗(yàn)。重組酵母MnP的表達(dá)活性低還可能與重組酶信號(hào)肽的選擇有關(guān)，畢赤酵母胞外表達(dá)外源蛋白時(shí)信號(hào)肽的選擇是影響外源蛋白表達(dá)量的一個(gè)重要因素，信號(hào)肽在引導(dǎo)蛋白分泌到胞外的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，不同的信號(hào)肽可導(dǎo)致目的蛋白分泌量的不同，可進(jìn)一步嘗試選用釀酒酵母的a因子前導(dǎo)肽（aMF）作為MnP基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的信號(hào)肽。外源基因在酵母中的表達(dá)活性低還與酵母的培養(yǎng)條件及酵母培養(yǎng)過(guò)程中外源表達(dá)蛋白產(chǎn)生的誘導(dǎo)條件有關(guān)，還需對(duì)重組酵母的培養(yǎng)條件和產(chǎn)生MnP的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。

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