楊潔 高聰 區(qū)騰飛 黃莉 陳夢宇 鄭揚(yáng)波 謝富華

EAE大鼠不同時(shí)間β-淀粉樣前體蛋白與Nogo蛋白受體表達(dá)的相關(guān)性

楊潔 高聰 區(qū)騰飛 黃莉 陳夢宇 鄭揚(yáng)波 謝富華

目的 探討β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)及Nogo蛋白受體(Ng R)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型大鼠病程中的表達(dá)變化及相互關(guān)系。方法 建立EAE動(dòng)物模型,于致敏第8天、致敏第21天、致敏第35天利用免疫組織化學(xué)方法觀察腦組織中β-APP及NgR表達(dá),并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 EAE致敏第8天、第21天及第35天組及空白對照組腦組織中β-APP表達(dá)灰度值分別為67.94±7.23、29.86±4.02、74.94± 8.16和117.25±10.11,四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=76.1,＜0.05),各實(shí)驗(yàn)組β-APP表達(dá)灰度值均低于對照組(均＜0.05),致敏第21天組低于致敏第8天組(=0.008),致敏第35天組高于致敏第21天組(=0.005),與致敏第8天組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.379)；相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腦組織中Ng R表達(dá)灰度值分別為90.28 ±8.74、76.75±6.59、77.64±9.58及45.33±5.26,四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=11.56,＜0.05),各實(shí)驗(yàn)組NgR表達(dá)灰度值均高于對照組(均＜0.05),致敏第35天組低于致敏第8天組(=0.049),致敏第8天組、致敏第35天組與致敏第21天組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.055,=0.975)。β-APP及NgR表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(=-0.207,＜0.05)。結(jié)論 軸索損傷可能在EAE早期即已出現(xiàn),并呈動(dòng)態(tài)變化。β-APP與NgR表達(dá)在EAE的病理進(jìn)展過程中呈負(fù)相關(guān)。

β-淀粉樣前體蛋白；Nogo蛋白受體；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；軸突生長抑制

軸索損害是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)最早期及進(jìn)展嚴(yán)重的表現(xiàn),是MS永久殘疾的重要病理因素［1］。β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)積聚在MS患者脫髓鞘斑形成的早期即可出現(xiàn),被認(rèn)為是軸索損害的一個(gè)特征性標(biāo)志。軸索生長抑制因子受體Nogo蛋白受體(NgR)是介導(dǎo)神經(jīng)軸索生長抑制的跨膜信號。既往研究表明NgR可能通過增加阿爾茨海默病動(dòng)物模型中的β-APP表達(dá)而加重淀粉樣斑的形成［2］。但二者在MS動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中是否有相似的變化,目前尚無研究證實(shí)。本研究擬通過觀察β-APP及NgR在EAE模型大鼠中的表達(dá)及兩者的關(guān)系,為探索軸索損傷及軸索生長抑制在EAE不同病理過程中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雌性Lewis大鼠(SPF級)96只,體質(zhì)量180～230 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供﹝許可編號SCXK(京)2007-0001﹞；豚鼠(清潔級)18只,雌雄不限,體質(zhì)量250～300 g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品與試劑 不完全福氏佐劑(IFA) (北京鼎國生物技術(shù)有限公司)；吸附無細(xì)胞白百破聯(lián)合疫苗(武漢生物制品研究所)；卡介苗(上海生物制品研究所)；兔抗β-APP及NgR一抗(英國Abcam公司)；UltraSensitiveTMS-P試劑盒和DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。誘導(dǎo)乳劑的制備：豚鼠經(jīng)麻醉后處死,行心臟灌注術(shù)。迅速在冰上取腦和脊髓,剪取白質(zhì)。按1 g白質(zhì)加1 m L磷酸鹽緩沖液(PBS)的比例,在冰盒中制成牛乳樣勻漿,與等體積完全福氏佐劑(CFA)充分混勻制成。CFA由IFA與100 mg/m L卡介苗按體積比3∶1比例混勻而成。

1.3 EAE模型建立 將大鼠分為EAE致敏8天組、致敏21天組、致敏35天組及空白對照組(對照組)4組,每組24只。參照文獻(xiàn)［3］的方法建立大鼠EAE模型。按體質(zhì)量0.35 g/kg予10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。按體質(zhì)量0.12 m L/100 g比例于EAE致敏8天組、致敏21天組、致敏35天組每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙后足墊皮下注射誘導(dǎo)乳劑,并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后足墊背面真皮內(nèi)注射0.2 m L吸附無細(xì)胞白百破聯(lián)合疫苗。致敏當(dāng)天記為第0天。每天稱體質(zhì)量,觀察動(dòng)物反應(yīng)是否靈敏,進(jìn)食水情況,大小便情況,尾部與肢體力量等,并參考Knono等標(biāo)準(zhǔn)［4］,進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,將病情嚴(yán)重程度分為5級(1～5分)。Ⅰ級：動(dòng)物尾部無力；Ⅱ級：尾部無力+肢體無力；Ⅲ級：肢體輕度麻痹；Ⅳ級：肢體嚴(yán)重麻痹,被動(dòng)翻身后不能復(fù)原；Ⅴ級：瀕死狀態(tài)。神經(jīng)功能缺損評分Ⅱ級及其以上為建模成功,其中評分Ⅲ級及以上為發(fā)病高峰期。對照組大鼠僅于致敏當(dāng)天雙后足墊皮下注射CFA。

各模型組按建模標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選取8只大鼠處死取腦組織,對照組在各模型組取材時(shí)間點(diǎn)分別選取8只大鼠取腦組織。余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在致敏后第70天過量麻醉處死。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 各模型組分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取大鼠各8只,對照組在各模型組取材時(shí)間點(diǎn)分別選取8只,處死取腦組織,以甲醛固定,置-20℃恒溫冷切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,片厚約20 μm,采用漂浮染色法進(jìn)行免疫組化染色。所需一抗為兔抗β-APP(1∶400)和Ng R(1∶400)。冷凍切片入漂洗盒,PBS反復(fù)換洗,加入過氧化物酶阻斷劑室溫下振蕩孵育30 min；PBS反復(fù)換洗5次后加入健康人非特異性血清室溫下振蕩孵育60 min；同組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本分為2組,分別加入上述一抗,室溫下振蕩60 min后,放入4℃冰箱中孵育過夜；從4℃冰箱中取出置室溫60 min；PBS反復(fù)換洗后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)在室溫下振蕩孵育45 min；PBS反復(fù)換洗后加入鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液室溫下振蕩孵育30 min；DAB液顯色,貼片,脫水,透明,中性樹脂封片鏡檢。隨機(jī)選取每組切片各12張,置200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不相重復(fù)的視野,采用Adobe Photoshop CS3 10.0圖像處理軟件進(jìn)行灰度轉(zhuǎn)換,用ImageJ 1.37V圖像分析軟件計(jì)算β-APP及NgR陽性細(xì)胞灰度值作為β-APP及NgR相對表達(dá)水平,計(jì)算平均值,并分析兩者的相關(guān)性。β-APP及NgR陽性細(xì)胞胞漿呈棕褐色,其灰度值越高,相應(yīng)β-APP及Ng R表達(dá)水平越高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。神經(jīng)功能評分、β-APP及NgR相對表達(dá)水平(即APP和NgR蛋白陽性細(xì)胞灰度值)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。β-APP及NgR相對表達(dá)多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK-檢驗(yàn)；β-APP及NgR表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 大鼠致敏后出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、皮毛不光滑、體重下降,致敏大鼠最早于致敏后第16天發(fā)病,最晚于致敏后第20天出現(xiàn)尾部張力減低、尾部無力。致敏第21天組動(dòng)物的臨床癥狀達(dá)到高峰期,多數(shù)動(dòng)物均出現(xiàn)雙后肢及尾部無力,尿便失禁,功能缺損評分為(4.16±0.54)。之后,動(dòng)物臨床癥狀逐漸緩解,約于致敏后第35天恢復(fù)完全,無一因病情危重而死亡,呈明顯的單向病程。對照組動(dòng)物無一發(fā)病。

圖1 各組大鼠腦組織皮層β-APP及NgR表達(dá)(免疫組化×200)

2.2 β-APP表達(dá) 對照組大鼠皮層陽性細(xì)胞染色較深(圖1)。其中致敏第21天組腦組織中陽性細(xì)胞水腫明顯,細(xì)胞輪廓模糊,陽性細(xì)胞淡染,致敏第8天組、致敏第35天組兩組細(xì)胞形態(tài)正常。各實(shí)驗(yàn)組β-APP表達(dá)灰度值與空白對照組四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=76.1,＜0.05)；各實(shí)驗(yàn)組β-APP表達(dá)灰度值均低于對照組(均＜0.05),致敏21天組低于致敏8天組(=0.008)；致敏35天組高于致敏21天組(=0.005),而與致敏8天組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.379)(表1)。

表1 各組大鼠β-APP及Ng R表達(dá)灰度值比較 ()

表1 各組大鼠β-APP及Ng R表達(dá)灰度值比較 ()

注：與對照組比較,*＜0.05；與致敏8天組比較,△＜0.05；與致敏21天組比較,#＜0.05

組別 β-APP NgR EAE致敏第35天組 74.94±8.16*#77.64±9.58*△EAE致敏第21天組 29.86±4.02*△ 76.75±6.59*△EAE致敏第8天組 67.94±7.23* 90.28±8.74*對照組 117.25±10.11 45.33±5.26

2.3 NgR表達(dá) 對照組大鼠腦組織皮層陽性細(xì)胞染色較淺,分布呈彌漫性(圖1)。EAE各模型組中腦組織皮層陽性細(xì)胞染色均較深,其中致敏第8天組與致敏第21天組兩組差別較小,致敏第35天組明顯深染。腦組織中Ng R表達(dá)灰度值各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=11.56,＜0.05)；各實(shí)驗(yàn)組Ng R表達(dá)灰度值均高于對照組(均＜0.05),致敏第35天組低于致敏第8天組(= 0.049),致敏第8天組、致敏第35天組與致敏第21天組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.055,= 0.975)(表1)。

3 討論

本研究中根據(jù)EAE病程,選擇EAE致敏第8、21及35天對應(yīng)EAE病程的炎性反應(yīng)初期、高峰期及恢復(fù)期的β-APP和NgR表達(dá)變化進(jìn)行觀察。

3.1 β-APP在EAE不同病理過程中的表達(dá)Tomimoto等［5］對沙土鼠腦中β-APP進(jìn)行超微定位,顯示增多的β-APP免疫活性局限于腫脹的軸索、營養(yǎng)不良的神經(jīng)元軸索和神經(jīng)元核周體中。Murakami等［6］研究顯示β-APP不僅在損傷灶及其周圍表達(dá),亦可在遠(yuǎn)離損傷灶的海馬表達(dá),并可導(dǎo)致部分神經(jīng)元死亡。上述研究均提示β-APP在其他神經(jīng)損傷模型中與軸索損傷有關(guān),但既往的研究對β-APP在EAE不同發(fā)病時(shí)程中的表達(dá)尚未完全明確。既往EAE模型的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在炎性反應(yīng)初期即出現(xiàn)片狀軸索脫失區(qū)域［7］。本實(shí)驗(yàn)中EAE第8天組β-APP在腦組織中的表達(dá)最高,也提示EAE急性期即出現(xiàn)軸索損傷。本研究表明EAE第21天組β-APP表達(dá)最低,提示此期軸索損傷較輕微,但既往銀染卻在此期顯示更多的軸索脫失和損傷區(qū)域［7］。出現(xiàn)這種矛盾結(jié)果的可能原因?yàn)椋篍AE模型組腦組織由于彌漫性炎性反應(yīng),細(xì)胞變性水腫導(dǎo)致了胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的合成和分泌障礙而致使β-APP表達(dá)下降。進(jìn)入恢復(fù)期后,即EAE第35天組,APP的表達(dá)又有所升高,但仍低于正常水平,這可能是由于炎性反應(yīng)消退,蛋白合成和分泌功能有所恢復(fù),而影響因素尚未未徹底消除,因此APP表達(dá)并未恢復(fù)正常。

綜上,MS發(fā)病初期可能即有軸索損傷,若在MS發(fā)病早期能及時(shí)給與保護(hù)軸索的治療,有可能阻止或延緩功能缺失進(jìn)展,從而減少永久性功能缺損,這具有非常重要的意義,需進(jìn)一步研究。

3.2 NgR在EAE動(dòng)物模型中表達(dá)及其與β-APP的關(guān)系 目前已確認(rèn)的中樞神經(jīng)髓鞘來源的抑制因子均為NgR的配體。當(dāng)髓鞘源性的抑制因子與NgR結(jié)合后,激活下游抑制通路,最終導(dǎo)致軸索再生障礙［8］。使用NgR阻滯劑可以局限EAE模型動(dòng)物的軸索損傷程度［9］。作為軸索急性損傷的標(biāo)記蛋白β-APP和軸索再生抑制的標(biāo)記物NgR,兩者在EAE模型中共表達(dá)及相關(guān)性分析可用于評價(jià)軸索再生抑制與軸索損傷可能的相互關(guān)系,但此前尚未有關(guān)于兩者的關(guān)系研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示,NgR灰度值在EAE致敏第8天組(90.28±8.74)較對照組(45.33±5.26)升高,在EAE致敏第21天組(76.75±6.59)較EAE致敏第8天降低但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而后在致敏第35天組(77.64±9.58)沒有明顯變化。對于恢復(fù)期的NgR持續(xù)高表達(dá),其結(jié)果與既往的研究相似。如Satoh等［10］在慢性MS患者的活動(dòng)病灶中發(fā)現(xiàn),NgR mRNA及NgR在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)均有上調(diào)。這提示即使在MS的慢性恢復(fù)期,軸索損傷抑制通路的信號仍然能夠被持續(xù)激活并下傳,從而導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷癥狀持續(xù)存在。

同時(shí),本研究還顯示β-APP與NgR表達(dá)在EAE的病理進(jìn)展過程中呈負(fù)相關(guān)(=-0.207,＜0.05)。軸索損傷早在EAE炎性反應(yīng)初始階段就已出現(xiàn),可能使得軸索再生抑制因子暴露并結(jié)合NgR,使NgR表達(dá)上調(diào)。在EAE發(fā)病高峰期,軸索再生抑制因子本應(yīng)釋放增加,但本實(shí)驗(yàn)中NgR表達(dá)水平仍低于EAE炎性反應(yīng)初期,可能由于發(fā)病高峰期細(xì)胞變性水腫,影響了內(nèi)部物質(zhì)的加工、合成和分泌。同時(shí)也提示在EAE的發(fā)病過程中,急性軸索損傷可能并不是激活軸索再生抑制通路的關(guān)鍵。本文作者既往的研究結(jié)果也表明,髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)與NgR的表達(dá)在EAE模型中呈正相關(guān),也表明神經(jīng)軸突生長抑制通路在EAE模型中可能由髓鞘損傷引起,而非由軸索損傷引起［11］。這也提示髓鞘保護(hù)治療應(yīng)該盡早進(jìn)行,以阻止其對軸索再生抑制通路的激活。

綜上可見,在EAE發(fā)病過程中軸索損傷可能在早期即出現(xiàn),并呈動(dòng)態(tài)變化,且β-APP與NgR表達(dá)在EAE的病理進(jìn)展過程中呈負(fù)相關(guān),提示在EAE中急性軸索損傷可能并不是激活軸索再生抑制通路的關(guān)鍵,軸索損傷與軸索再生抑制通路的激活之間關(guān)系尚需進(jìn)一步研究明確。

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GAO Cong,Email：smilegaocong@126.com

Objective To explore the mechanism of axonal injury and axonal regeneration inhibition pathways on experimental allergic encephalomyelitis(EAE)model by investigating the express ofβ-amyloid precursor protein(β-APP)and Nogo receptor(Ng R).Methods We established EAE model and then investigated the expression ofβ-APP and NgR in their brain with immunohistochemistry method at D8,D21 and D35 of EAE,respectively,to evaluate the association betweenβ-APP and NgR.Results The expression ofβ-APP was 67.94±7.23,29.86±4.02,74.94±8.16 and 117.25 at D8,D21,D35 and control group, respectively.And the P-values between each time are 0.008(D8.D21),0.005(D21.D35).The expression of Ng R was 90.28±8.74,76.75±6.59,77.64±9.58 and 45.33±5.26 at D8,D21,D35 and control group, respectively.And the-values between each time are 0.055(D8.D21)and 0.049(D8.D35).The rectilinear correlation analysis showed that the expression ofβ-APP and Ng R were negatively correlated in the whole EAE phase(=-0.207,＜0.05).Conclusions Axonal injury happened at the early stage of EAE. The expression ofβ-APP and NgR changed during the phases of EAE.

β-APP；NgR；EAE；axonal regeneration inhibition

R744.5

：A

：1006-2963(2014)05-0328-04

2013-04-25)

(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.05.006

廣東省自然基金項(xiàng)目(S2013010016262)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B031800240)

510260廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(楊潔、高聰、黃莉、陳夢宇、鄭揚(yáng)波)；528000佛山市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(區(qū)騰飛)；510260廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(謝富華)

高聰,Email：smilegaocong@126.com