呂寒,馬麗,任冰如,陳劍,李維林,劉艷

(江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇省抗糖尿病藥物篩選服務中心,南京 210014)

蠶沙中1-脫氧野尻霉素提取工藝研究*

呂寒,馬麗,任冰如,陳劍,李維林,劉艷

(江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇省抗糖尿病藥物篩選服務中心,南京 210014)

目的 優(yōu)化蠶沙中1-脫氧野尻霉素(DNJ)的提取工藝。方法通過高效液相色譜法測定DNJ含量,比較不同溶劑、提取方法、提取次數(shù)對DNJ含量的影響,并通過正交實驗方法比較不同因素的影響。結果在提取效果的影響因素中,影響程度大小依次為鹽酸濃度>提取時間>提取溫度。蠶沙中DNJ提取最佳工藝為:10倍0.1 mol·L-1鹽酸為提取溶劑,80℃水浴加熱提取2次,每次1 h。結論該提取工藝提取率高,穩(wěn)定可靠,可用于蠶沙中DNJ的提取。

蠶沙;1-脫氧野尻霉素;提取工藝

蠶沙為家蠶(Bombyx moriL.)幼蟲蠶食桑葉后排泄出來的糞便[1],始載于《名醫(yī)別錄》,《本草綱目》列于蟲部。蠶沙有祛風除濕、清熱明目、活血定痛的功能,在一些治療糖尿病的復方中常使用蠶沙[2]。研究表明,蠶沙總生物堿具有抗糖尿病作用[3],而蠶沙總生物堿中主要成分為1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ),具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,是蠶沙治療糖尿病的主要有效成分[4]。筆者在本實驗中應用正交實驗方法比較不同提取條件對DNJ提取率的影響,以期為開發(fā)蠶沙中生物堿類成分提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler EL204電子天平,Dionex-Ultimate 3000高效液相色譜儀,Alltech3300 ELSD檢測器。

1.2 試劑與藥品 蠶沙[收集于江蘇省南通市,自然晾干后,除去石灰、沙子等雜質,批號:20100612,由李維林研究員鑒定為家蠶(Bombyx moriL.)幼蟲的糞便]。DNJ(由本所從蠶沙中提取精制,經液相色譜檢測,含量為98.5%),001×7強酸型陽離子交換樹脂(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20120108),乙腈(美國天地公司,色譜純,批號:1012441),水為超純水,乙醇(南京化學試劑廠,批號:1002411526)、鹽酸(南京化學試劑廠,批號:10031130170)均為分析純。

2 方法與結果

2.1 不同溶劑比較 取蠶沙2.5 g精密稱定,5份,分別加入0.01 mol·L-1鹽酸、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇,均25 mL,50℃超聲提取1 h,提取液濾過,減壓濃縮蒸干。干浸膏以0.01 mol·L-1鹽酸10 mL溶解,通過001×7強酸型陽離子交換樹脂,以水洗脫至pH中性,再以0.5 mol·L-1氨水30 mL洗脫,收集氨水洗脫液,減壓濃縮蒸干。干浸膏以純水溶解,轉移至10 mL量瓶,以水定容。溶液以0.45 μm微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。按“2.4”項方法檢測含量。提取率(%)=氨水洗脫干浸膏中DNJ含量(mg)/蠶沙藥材中DNJ含量(mg)×100%。

2.2 不同提取方法比較 取蠶沙2.5 g2份精密稱定,分別加入0.01 mol·L-1鹽酸25 mL。其中一份以50℃超聲提取1 h,一份以100℃水浴提取1 h,提取液濾過,減壓濃縮蒸干。其余操作同“2.1”項。

2.3 不同提取次數(shù)比較 取蠶沙2.5 g2份精密稱定,分別加入0.01 mol·L-1鹽酸25 mL。1份以100℃水浴提取1 h,另1份以100℃水浴提取2次,每次1 h,提取液濾過,減壓濃縮蒸干。其余操作同“2.1”項。

2.4 含量測定

2.4.1 對照品溶液的配制 取DNJ對照品精密稱定,加超純水溶解,配制成0.29 mg·mL-1對照品溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜柱為Inerstil NH2(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流動相為乙腈-水(80∶20);流速1.0 mL·min-1;柱溫35℃;進樣量20 μL。ELSD檢測器參數(shù):漂移管溫度50℃,載氣流速1.5 L·min-1。

2.4.3 標準曲線的繪制 分別吸取對照品溶液5, 10,15,20,25,30 μL,注入液相色譜儀,按“2.4.2”項色譜條件,測定峰面積,以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),進行線性回歸。得回歸方程分別為:Y=225 588X-112 834(R2=0.999 8),結果DNJ在1.45～8.7 μg內線性關系良好。

2.4.4 精密度實驗 精密吸取對照品溶液,在上述色譜條件下重復進樣6次,每次20 μL,對照品峰面積RSD為0.75%,說明該儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液,在上述色譜條件下分別于0,2,4,8,12,24 h進樣測定,結果DNJ含量RSD為2.5%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.4.6 重復性實驗 取蠶沙2.5 g6份精密稱定,分別加入0.01 mol·L-1鹽酸25 mL,100℃水浴提取1 h,提取2次,其余操作同“2.1”項,在上述色譜條件下測定樣品中DNJ含量,結果樣品DNJ含量RSD為2.1%,說明該方法有很好的重復性。

2.4.7 加樣回收率實驗 取蠶沙1.25 g6份精密稱定,分別精密加入對照品溶液(濃度2.9 mg·mL-1) 0.5 mL,分別加入0.01 mol·L-1鹽酸25 mL,100℃水浴提取1 h,提取2次,其余操作同“2.1”項,在上述色譜條件下測定樣品中DNJ含量,計算加樣回收率,結果見表1。表明本方法回收率良好。

表1 DNJ的加樣回收實驗結果

2.5 正交實驗 根據(jù)預實驗結果,以鹽酸濃度、提取溫度、提取時間為實驗因素,每個因素設3個水平,進行L9(34)正交實驗(表2)。取2.5 g蠶沙9份精密稱定,按正交表中條件分別加入不同濃度鹽酸,分別以不同提取溫度和提取時間水浴提取,濾過,得提取液,提取液濾過,減壓濃縮蒸干,稱重。干浸膏以0.01 mol·L-1鹽酸10 mL溶解,并通過001×7強酸型陽離子交換樹脂,以水洗脫至pH中性,再以0.5 mol·L-1氨水30 mL洗脫,收集氨水洗脫液,減壓濃縮蒸干,稱重。干浸膏以超純水溶解,轉移至10 mL量瓶,并以水定容至刻度。溶液以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。按“2.4”項方法檢測,計算DNJ含量。

表2 L9(34)實驗因素水平表

2.6 結果與分析

2.6.1 不同溶劑比較 不同溶劑對DNJ提取率影響見表3。從結果中可見,隨著乙醇濃度增加DNJ提取率明顯下降,0.01 mol·L-1鹽酸的提取率最高,所以選擇稀鹽酸溶液作為提取溶劑。

表3 不同溶劑DNJ提取率

2.6.2 不同提取方法比較 水浴加熱提取和超聲提取DNJ提取率分別為81.7%和70.8%,結果可見水浴加熱較超聲提取率高,所以選擇水浴加熱提取。

2.6.3 不同提取次數(shù)比較 1次提取和2次提取DNJ提取率分別為81.7%和87.1%,2次提取較1次提取的提取率高,所以選擇2次提取。

2.6.4 正交實驗結果 正交實驗結果見表4,方差分析(表5)表明,酸濃度對葉DNJ含量有顯著影響,提取溫度和提取時間無顯著影響,影響程度大小依次為鹽酸濃度>提取時間>提取溫度。直觀分析最佳工藝條件是A1B3C1,由于提取時間無顯著差異,從生產角度考慮,選擇A1B3C3,即0.1 mol·L-1鹽酸,80℃水浴提取2次,每次1 h。

表4 L9(34)正交實驗結果

表5 方差分析結果

2.7 驗證實驗 按照優(yōu)化的條件進行最佳工藝的驗證實驗,重復3次,結果DNJ提取率為91.1%,92.1%, 92.3%,平均提取率為91.8%。陽離子交換樹脂氨水洗脫液干浸膏DNJ含量分別為2.61%,2.54%, 2.67%,平均含量為2.61%。表明正交實驗所得的最佳工藝穩(wěn)定,可行。

3 討論

DNJ分子結構中不含發(fā)色團,在紫外和可見光范圍內均無吸收,采用紫外檢測器無法分析。目前多采用柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測法和柱前衍生化-紫外檢測法,兩者利用了特殊的熒光試劑芴甲氧羰酰氯(9-Fluorenylmethyl Chloroformate,FMOC-C1)與DNJ柱前衍生,使反應后的產物可以用熒光或紫外檢測器來檢測[5-6],但是衍生化技術操作繁瑣、費時,需要考慮反應的相關條件及副產物的處理等問題。本實驗采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法,該方法無需對樣品進行衍生化,操作較簡便,準確性和重復性較好。DNJ極性很大,用常規(guī)的C18色譜柱保留時間很短,本實驗選用氨基柱,并通過優(yōu)化色譜條件使主峰與雜質峰得到很好的分離。

預實驗中發(fā)現(xiàn)蠶沙提取中有很多非生物堿類雜質,不經處理直接進行液相分析會影響檢測,本實驗采用陽離子交換的方法,可以有效去除非生物堿類雜質,減少后期液相分析的雜質干擾。

不同溶劑篩選結果可見,稀鹽酸溶液對DNJ的提取率高于乙醇溶液,這和其極性大且為堿性的結構有關。本實驗通過正交實驗方法,確定了10倍0.1 mol·L-1鹽酸為提取溶劑,80℃水浴加熱提取2次每次1 h的最佳工藝。該工藝經過3次放大實驗,重復性良好,為蠶沙中生物堿類開發(fā)提供了基礎。

[1] 郭寶星.蠶沙及其提取物在醫(yī)學上的應用[J].四川中醫(yī), 2003,21(3):19-21.

[2] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:上海人民出版社, 1988:1830-1831.

[3] 朱元元,白鋼,朱文杰,等.一種蠶沙總生物堿及其制備方法:中國,200510122258.X[P].2005-12-09.

[4] 周光雄,阮杰武,黃關燕,等.蠶沙中生物堿成分研究[J].中藥材,2007,30(11):1384-1385.

[5] JIN W K,S00 U K,HEUI S L,et al.Determination of 1-deoxlImojiriInvcin inMorus albaL.leaves by derivatization with 9-flurenylmethyl chlorofomate followed by reversedphase high-performance liquid chromatography[J].J Chrom A,2003,1002(1):93-99.

[6] 施新琴,崔為正,裘立群.用反相高效液相色譜-紫外檢測法測定1-脫氧野尻霉素的含量[J].蠶業(yè)科學,2006,32 (1):146-149.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.029

R286;TQ460.1

B

1004-0781(2014)11-1506-03

2013-11-15

2013-12-20

*江蘇省科技支撐計劃-社會發(fā)展項目(BE2011787);江蘇省科技基礎設施建設計劃-科技公共服務平臺項目(BM2011117)

呂寒(1980-),女,浙江永康人,助理研究員,碩士,主要從事植物有效成分分離。電話:025-84347081,E-mail:xiaohan1814@163.com。

李維林(1966-),男,陜西漢中人,研究員,博士,主要研究方向為經濟植物引種馴化、成分分離。電話:025-84347002,E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net。