劉 邦，劉 鈞，蹇順海，黃一凡，韓穎蘋，付秋娟，聶 佳

(1.儀隴縣人民醫(yī)院腫瘤科，四川 儀隴 637641;2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

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近年來研究表明，鉀離子通道是細胞膜上重要的離子通道，并參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡，可以為腫瘤治療提供新的靶點［1］。其中Eag1(ether à go-go，Eag1)鉀離子通道是研究相對較多的一種，Eag1 通道在其細胞內(nèi)部分存在一個氧感受器(PAS)區(qū)，腫瘤細胞在生長過程中發(fā)生缺氧時，Eag1通道表達增高，并且在低氧環(huán)境下誘導低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的大量轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生糖酵解增加及血管生成增多等一系列低氧適應反應，從而使腫瘤細胞在缺氧環(huán)境中繼續(xù)生長發(fā)展［2］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最關(guān)鍵的血管生成調(diào)節(jié)因子，可以增加血管通透性，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡并刺激其增殖，從而促使血管生成，促進腫瘤生長。Eag1、HIF-1α、VEGF 均與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但三者聯(lián)合檢查尚未見報道。本文采用免疫組化方法檢測慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸鱗癌組織中Eag1、HIF-1α 及VEGF 的表達情況，分析三者與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系，并分析Eag1、HIF-1α 及VEGF 的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2006 年6 月至2012 年6 月經(jīng)病理確診病例的石蠟蠟塊，其中慢性炎癥宮頸組織40 例，CIN 40 例(其中CINⅠ～Ⅱ20 例，CINⅢ20 例)，宮頸鱗癌100 例。100 例宮頸鱗癌均為手術(shù)切除標本，均有完整臨床病理資料，其中50 例術(shù)前先接受放射治療，年齡33 ～65 歲，平均年齡49 歲。按照世界衛(wèi)生組織(WHO，2003)子宮頸癌組織學分類標準，角化型47 例，非角化型45例，其他類型宮頸鱗癌8 例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66 例。臨床分期根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2009)宮頸癌分期標準，由婦科醫(yī)生根據(jù)臨床檢查確定臨床分期，早期宮頸癌即Ⅰ～Ⅱa 期63 例;中晚期宮頸癌Ⅱb 及Ⅱb 期以上37 例。

1.2 實驗方法及試劑

Eag1 兔抗人多克隆抗體和HIF-1α 兔抗人多克隆抗體均購自北京雷根生物技術(shù)有限公司(中國)，VEGF 兔抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(中國)。將原病例常規(guī)石蠟包埋的蠟塊，作4 μm 連續(xù)切片4 張，分別作HE 染色，Eag1、HIF-1α 和VEGF 免疫組化染色(SP 法)。免疫組化染色各步驟均按試劑盒說明書嚴格操作。已知陽性切片為陽性對照，以PBS 代替一抗為陰性對照。

1.3 判斷標準

Eag1 為光鏡下細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)染成棕黃色者為陽性表達(圖1);HIF-1α 為光鏡下以腫瘤細胞核內(nèi)或胞質(zhì)有棕黃色細顆粒者為陽性表達(圖2);VEGF 為光鏡下以腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色細顆粒者為陽性表達(圖3)。雙盲法觀察切片，采用半定量積分法進行分級［3］，每張切片隨機選擇具有代表性的10 個高倍鏡視野(×400)進行計數(shù)，每個視野計數(shù)100 個細胞，共計1 000 個細胞，計算陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的百分率，分級如下:不論其染色強弱如何，陽性細胞少于或等于10%計為0 分;陽性細胞為11% ～30%，計為1 分;陽性細胞為31% ～75%，計為3 分，＞75%為3 分;根據(jù)細胞染色強度分級如下:無色為0 分，淺黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積≤1 分為陰性，1 ～2 分為弱陽(+)，2 ～4 分為陽性(+ +)，＞4 分為強陽(+ + +)。若兩人判斷結(jié)果相差2 分則重新判定。

圖1 Eag1 在宮頸癌中的表達（SP×200）

圖2 HIF-1α 在宮頸癌中的表達（SP×200）

圖3 VEGF 在宮頸癌中的表達（SP×200）

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS19.0 軟件，采用χ2檢驗，方差分析及Spearman 等級相關(guān)分析方法進行統(tǒng)計分析，以P ＜0.05 表示結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，P ＜0.01 表示結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Eag1、HIF-1α 和VEGT 在不同病變宮頸組織中的表達

從表1 可知，Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表達在CIN、宮頸鱗癌均顯著增加，均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

表1 Eag1、HIF-1α 和VEGT 在不同病變宮頸組織中的表達

2.2 Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表達與宮頸癌臨床病理特點

從表2 可知，Eag1、HIF-1α 及VEGF 陽性表達率在非角化型鱗癌中高于角化型、Ⅱb 及以上期高于Ⅰ～Ⅱa 期、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯升高，均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

表2 Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表達與臨床病理特點

2.3 Eag1、HIF-1α 和VEGT 蛋白在放射治療前后的表達

從表3 可知，放療前Eag1、HIF-1α 及VEGF 陽性表達率較放射治療后陽性表達率明顯下降，兩者比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

2.4 宮頸鱗癌中Eag1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表達的相關(guān)性

從表4 可知，子宮頸鱗癌組織中Eag1 蛋白與HIF-1α 蛋白的表達(r =0.291)及VEGF(r =0.297)蛋白的表達均呈正相關(guān)(均為P ＜0.01)。子宮頸鱗癌組織中HIF-1α 蛋白與VEGF 蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.294，P ＜0.01)。因此，Eag1、HIF-1α 與VEGF三者在宮頸癌組織中的表達呈正相關(guān)性。

表4 宮頸鱗癌組織中Eag1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

3.1 Eag1 在宮頸不同病變組織中的表達及其臨床意義

在人類，Eag 家族被發(fā)現(xiàn)有8 個成員，而成員之一Eag1(Kv10.1，KCNH1)鉀通道被認為是Eag 家族中與惡性腫瘤關(guān)系最為密切的鉀通道之一［4］。在正常組織中Eag1 鉀離子通道蛋白主要存在于腦組織，在胎盤和成肌細胞中也有少量表達［5］。在多種上皮性腫瘤組織中鉀通道蛋白均有高表達，如肝癌、胰腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢囊腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、支氣管癌等［6］。

本實驗顯示宮頸鱗癌組織中Eag1 蛋白的陽性表達率高于CIN 組和宮頸慢性炎癥組，CIN 組Eag1蛋白的陽性表達率高于宮頸慢性炎癥組。Eag1 蛋白的表達率在非角化型宮頸鱗癌高于角化型鱗癌，晚期宮頸癌(Ⅱb 及Ⅱb 期以上)高于中早期宮頸癌(Ⅰ～Ⅱa 期)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且隨著病變程度的加重，Eag1 表達逐漸增高。提示Eag1 鉀通道蛋白的表達在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中起十分重要的作用，并且與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該結(jié)果與林爽等［7］研究結(jié)果一致。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)Eag1 的表達與宮頸癌組織學類型也有密切關(guān)系，該結(jié)論與現(xiàn)有報道不太一致，有待進一步增加病例數(shù)充實該項結(jié)論。

研究中，還選擇了50 例放射治療前后標本對比觀察Eag1 的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療前Eag1 的陽性表達率高于放療后。進一步觀察時發(fā)現(xiàn)，5 例在放療前Eag1 呈弱陽性表達的患者，完成放射治療后，經(jīng)手術(shù)切除的標本中，僅見少量癌殘留，可見明顯炎癥反應和壞死。而強陽性表達的患者放療后癌組織均殘存較多。Eag1 在惡性腫瘤組織放療前后的表達情況尚未見報道，初步分析放療后Eag1 表達減少的原因可能是:①經(jīng)過放射治療后腫瘤細胞抗原發(fā)生丟失，造成Eag1 表達減少;②放射后癌組織體積縮小甚至不見癌殘留，從而影響陽性表達;③放射過程中會使宮頸組織中的微血管和淋巴管發(fā)生閉塞，造成腫瘤壞死組織增多，從而影響Eag1 的表達。我們認為，Eag1 的表達與放療效果之間存在相關(guān)性，癌組織中低表達者對放射治療敏感，放療效果好于高表達者，原因可能是Eag1 的高表達會促使HIF 轉(zhuǎn)錄增多，促使血管生成增多，使腫瘤組織適應缺氧環(huán)境，增加腫瘤內(nèi)部乏氧區(qū)域，造成放射抵抗，影響放射治療效果。林爽等［8］應用鉀通道阻斷劑四氨基吡啶(4-amino-pyridine，4-AP)研究宮頸癌Hela 細胞時發(fā)現(xiàn)，4-AP 能增加宮頸癌細胞對中子照射的敏感性。分析認為4-AP 能明顯降低HIF-1α 表達，降低HIF-1α 高表達所致的腫瘤低氧性放療抵抗。進一步說明Eag1 的表達與腫瘤治療密切相關(guān)，有望成為腫瘤靶向治療的靶點。

3.2 HIF-1α 在宮頸不同病變組織中的表達及其臨床意義

缺氧誘導因子(HIF-1)是人體細胞發(fā)生缺氧應答時的關(guān)鍵性調(diào)控因子，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α 會在缺氧信號的刺激下大量轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄出的HIF-1蛋白表達穩(wěn)定，進而促進一系列缺氧反應基因的轉(zhuǎn)錄，進而促進多種缺氧適應蛋白的合成，促進腫瘤細胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移［9-10］。

本研究顯示宮頸鱗癌組織中HIF-1α 蛋白的陽性表達率高于CIN 組和宮頸慢性炎癥組，CIN 組HIF-1α 蛋白的陽性表達率高于宮頸慢性炎癥。進一步分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌病理分化程度愈低、臨床分期得愈晚以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，HIF-1α 蛋白的陽性表達率表達愈高。這與結(jié)腸癌、胃癌的研究結(jié)果相似［11-12］。結(jié)果提示隨著宮頸病變的進展，缺氧程度不斷加重，腫瘤細胞內(nèi)HIF-1α 濃度增加，促使相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，促使宮頸癌病變進展。50 例宮頸癌放療前HIF-1α 陽性表達率是48%，放療后為22.8%，放療后明顯下降，具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，再進一步觀察發(fā)現(xiàn)，5 例放療前HIF-1α 呈弱陽性表達的患者，經(jīng)過放療后手術(shù)標本中，僅見少量癌細胞殘留，提示HIF-1α 的表達與放療效果之間存在相關(guān)性，癌組織中低表達者對放射治療敏感，放療效果好于高表達者，這與宋娜莎［13］研究結(jié)果類似。

3.3 VEGF 在宮頸不同病變組織中的表達及其臨床意義

VEGF 是誘導腫瘤產(chǎn)生新生血管的關(guān)鍵因子之一。黃一凡等［14］在應用實時熒光定量(PCR)和免疫組化法檢測結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中VEGFmRNA 及VEGF 蛋白的表達情況時發(fā)現(xiàn)，VEGF 蛋白的表達與結(jié)腸癌發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分類及Dukes 分期呈正相關(guān)(P ＜0.05)。

本實驗研究顯示宮頸鱗癌組織中VEGF 蛋白的陽性表達率高于CIN 組和宮頸慢性炎癥組，CIN 組VEGF 蛋白的陽性表達率高于宮頸慢性炎癥。非角化型鱗癌中VEGF 的表達高于角化型鱗癌，早期宮頸癌(Ⅰ～Ⅱa 期)VEGF 蛋白表達率低于晚期宮頸癌(Ⅱb 及Ⅱb 期以上)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF蛋白的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。說明VEGF在宮頸癌的生長發(fā)展，侵襲過程中起著重要作用，與子宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預后不良有密切聯(lián)系。

放療前宮頸鱗癌VEGF 的陽性表達率是56%，放療后降為24%，放療前VEGF 陽性表達率明顯高于放療后。提示VEGF 在宮頸鱗癌放射治療過程中發(fā)揮重要的作用，可作為宮頸鱗癌放射治療療效的預測指標之一。

3.4 Eag1、HIF-1α、VEGF 在宮頸不同病變組織中表達的相關(guān)性

從表1 -4 中可知，Eag1、HIF-1α、VEGF 三者均隨宮頸鱗癌的進展而表達增高，并且三者呈正相關(guān)表達。我們推測在宮頸鱗癌的生長發(fā)展過程中，Eag1 鉀離子通道的激活與腫瘤的缺氧狀態(tài)和血管生成密切相關(guān)。腫瘤組織在體積增大到一定程度后中央?yún)^(qū)域必然會發(fā)生缺氧［15］，Eag1 鉀離子通道感受到腫瘤細胞缺氧信息后將低氧信息傳遞到細胞核內(nèi)，激活HIF-1α 基因的表達，在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的HIF-1α，過多的HIF-1α 蛋白又進一步促進VEGF 蛋白的表達增多，Eag1、HIF-1α，VEGF 大量表達的結(jié)果是為腫瘤細胞的持續(xù)增生提供營養(yǎng)，促進腫瘤細胞增殖，腫瘤體積增大。

綜上所述，我們認為Eag1、HIF-1α、VEGF 聯(lián)合檢查可作為宮頸鱗癌早期診斷、判斷腫瘤浸潤進展和預后的指標，有望成為宮頸鱗癌患者的治療新靶點。

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