龐 潔，高懷林，王宏濤，魏 聰，吳以嶺△

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046;2.河北以嶺醫(yī)藥研究院(河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，石家莊 050035;3.國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(心腦血管絡(luò)病)，石家莊 050035;4.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院，石家莊 050092)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長并已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一。胰島β細(xì)胞分泌的胰島素作為體內(nèi)惟一的降血糖激素，其分泌不足及作用缺陷一直是糖尿病防治的研究熱點(diǎn)。然而研究發(fā)現(xiàn)，胰島α、δ細(xì)胞分泌的胰高血糖素、生長抑素及垂體分泌的生長激素與糖尿病血糖調(diào)節(jié)同樣有著密切關(guān)系，并與胰島素相互作用共同參與血糖調(diào)控。津力達(dá)顆粒是“從脾論治”消渴病(糖尿病)理論觀點(diǎn)指導(dǎo)下研制出的中成藥制劑。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，津力達(dá)具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗及保護(hù)心腦腎靶器官等作用[1-3]，但關(guān)于津力達(dá)對血糖調(diào)節(jié)相關(guān)激素及胰島細(xì)胞功能作用的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在通過高脂飲食誘導(dǎo)聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠血清胰島素、胰高血糖素、生長激素及胰島內(nèi)分泌細(xì)胞功能變化及津力達(dá)顆粒干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物

48只健康雄性SPF級Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自中國食品藥品檢定研究院(許可證編號SCXK(京)2009-0017)，飼養(yǎng)于河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院新藥評價(jià)中心。動物房分籠飼養(yǎng)，5只/籠，12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物與試劑

干預(yù)藥物:津力達(dá)干粉(批號120512，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)及鹽酸羅格列酮(批號20120202，貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司)。主要試劑:拜安康血糖檢測試紙(FAD葡萄糖脫氫酶法，德國拜耳)，鏈脲佐菌素(STZ，AMRESCO)，胰島素放射免疫試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)，胰高血糖素ELISA試劑盒(MILLIPORE)，生長激素ELISA試劑盒(MILLIPORE)，小鼠抗大鼠胰島素抗體(Novus biological)，兔抗大鼠胰高血糖素抗體(ImmunoWay)，兔抗生長抑素抗體(SANTA CRUZ)，羊抗大鼠胰多肽抗體(Abcam)，免疫組化SP法試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 主要儀器

拜安康血糖儀，Biofuge primo R高速冷凍離心機(jī)(美國索富達(dá))，XD711酶標(biāo)儀(上海迅達(dá)醫(yī)療器械公司)，QB-9001微孔板快速振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)，LeicaDM6000B顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 分組給藥及模型建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，正常對照組喂食基礎(chǔ)飼料，其余各組喂食高脂飼料(熱量構(gòu)成:脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質(zhì)20.1%)，每組12只。高脂喂養(yǎng)4周后進(jìn)行模型建立，造模前日禁食12 h以上，不禁水，腹腔注射STZ 45 mg/kg，造模3 d后尾靜脈取血測定空腹血糖(FBG)≥13.9 mmol/L為造模成功[4]。符合造模成功標(biāo)準(zhǔn)的動物隨機(jī)分為正常組(Normal)、模型組(Model)、津力達(dá)組(JLD)及羅格列酮組(RSG)4組，按照分組每日分別灌服0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(正常組和模型組)、津力達(dá)干粉1.5 g/kg、鹽酸羅格列酮0.67 mg/kg，繼續(xù)給予高脂飲食及藥物干預(yù)8周。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素測定 造模前日禁食12 h以上，不禁水，10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，由腹主動脈取血，全血取出室溫靜置2 h，高速冷凍離心機(jī)3500 rpm離心10 min，收集血清樣本并在－20℃低溫冰箱儲存。血清胰島素采用放射免疫法檢測，血清胰高血糖素及生長激素檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 免疫組織化學(xué)法檢測胰島內(nèi)胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽表達(dá)及平均光密度分析 每組選取4只動物，10%中性甲醛固定胰腺組織樣本，石蠟包埋，5 μm切片，每只動物標(biāo)本不連續(xù)切片3張，切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，H2O2室溫20 min，正常羊血清室溫封閉30 min，分別孵育胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽抗體4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。以PBS代替特異性抗體進(jìn)行陰性對照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus軟件分析并計(jì)算陽性表達(dá)區(qū)域平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，方差不齊用Dunnertt’sT3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素變化情況

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、血清胰高血糖素及生長激素均顯著升高，同時(shí)血清胰島素水平顯著降低(P＜0.01)。藥物干預(yù)后空腹血糖及血清中各激素水平發(fā)生不同程度變化，津力達(dá)、羅格列酮干預(yù)后空腹血糖、胰高血糖素及生長激素水平降低，血清胰島素水平升高，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各組大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素(s)

表1 各組大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素(s)

注:與正常組比較:#P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù) 空腹血糖(mmol/L)胰島素(μIU/mL)胰高血糖素(ng/L)生長激素(ng/ml)正 常 組4.37±0.61 23.90±3.30 41.56± 3.31 1.30± 1.00模 型 組 7 29.66±4.20# 14.44±1.67# 67.00±13.64# 59.30±10.11#津 力 達(dá) 組 7 22.8±2.01#* 18.14±3.57#* 48.01±12.11#＊＊ 5.15± 1.51＊＊羅 格 列 酮 組 7 22.44±2.33#* 18.06±2.13#* 47.26±5.49#＊＊ 15.40± 4.44 8＊＊

2.2 胰島內(nèi)分泌細(xì)胞免疫組化觀察

免疫組化結(jié)果顯示，正常組胰島β細(xì)胞分布在胰島中央，胰島素在胰島大部分區(qū)域表達(dá)，呈深棕色染色(圖1A);模型組中β細(xì)胞胞質(zhì)著色變淺，胰島素表達(dá)明顯減少且分布雜亂(圖1B);津力達(dá)、羅格列酮組胰島素表達(dá)較模型組增多且分布以中心部為多(圖1C、D)。正常組胰島α細(xì)胞主要分布在胰島周邊部位(圖2A);模型組α細(xì)胞顯著增生，細(xì)胞變密集且染色加深，胰高血糖素表達(dá)明顯增加(圖2B);津力達(dá)、羅格列酮組胰高血糖素與模型組比較表達(dá)減少(圖2C、D)。正常組胰島δ、PP細(xì)胞數(shù)量很少，僅散在分布于胰島周邊(圖2E、I);模型組2種細(xì)胞數(shù)量均明顯增多，生長抑素及胰多肽表達(dá)增加(圖2F、J)，與模型組比較津力達(dá)、羅格列酮組生長抑素(圖2G、H)及胰多肽(圖2K、L)表達(dá)變化不明顯。

圖1 大鼠胰島β細(xì)胞免疫組化染色(DAB×200)

圖2 大鼠胰島α、δ、PP細(xì)胞免疫組化染色(DAB×200)

2.3 胰島內(nèi)分泌細(xì)胞陽性表達(dá)平均光密度分析

表2顯示，與正常組比較，模型組胰島β細(xì)胞分泌的胰島素表達(dá)平均光密度顯著降低，胰島α、δ、PP細(xì)胞分泌的胰高血糖素、生長抑素及胰多肽表達(dá)平均光密度均顯著升高(P＜0.01)。津力達(dá)、羅格列酮組胰島素表達(dá)平均光密度顯著升高，胰高血糖素表達(dá)則明顯降低，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與模型組比較，津力達(dá)、羅格列酮組生長抑素表達(dá)雖略有升高，胰多肽表達(dá)有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)消渴病范疇，既往雖以肺胃腎三消論治，但究其原因皆歸于脾。正如張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中曰:“消渴一證，古有上中下之分，謂其證皆起于中焦而極于上下?！逼⒅\(yùn)化轉(zhuǎn)輸功能失常，引起機(jī)體水液代謝輸布及飲食精微轉(zhuǎn)輸利用紊亂及不平衡。早在《素問·太陰陽明論》就有“脾與胃以膜相連耳。”至張介賓《類經(jīng)·圖翼諸部經(jīng)穴次序》中認(rèn)為，脾“形如刀鐮，胃同膜而附其上之左”，這與西醫(yī)學(xué)中胰腺的解剖位置與形態(tài)是基本一致的，并據(jù)此認(rèn)為中醫(yī)歷代所論之“脾”包括胰腺在內(nèi)。而就脾之功能而言，水谷精微經(jīng)由脾氣轉(zhuǎn)輸布散至全身，內(nèi)養(yǎng)五臟六腑、外濡四肢百骸而實(shí)現(xiàn)其主運(yùn)化功能，而這一功能的實(shí)現(xiàn)有賴于胰腺外分泌腺分泌的多種消化酶及內(nèi)分泌腺分泌胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽對水谷精微物質(zhì)主要成分葡萄糖的利用、合成、貯存及異生，因此認(rèn)為胰腺是“脾主運(yùn)化”功能實(shí)現(xiàn)的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。津力達(dá)顆粒以益脾氣之人參，滋脾陰之黃精、麥冬、葛根，化脾濕之蒼術(shù)、佩蘭、茯苓，泄脾熱之苦參、黃連、知母，溫脾陽淫羊藿為主要成分，并佐以祛瘀生新之丹參及調(diào)暢氣機(jī)之荔枝核，諸藥相合共奏益氣養(yǎng)陰、健脾運(yùn)津之效，旨在恢復(fù)脾(胰腺)主運(yùn)化水谷精微之功能[5]。

表2 各組大鼠胰島內(nèi)分泌細(xì)胞陽性表達(dá)平均光密度分析(s)

表2 各組大鼠胰島內(nèi)分泌細(xì)胞陽性表達(dá)平均光密度分析(s)

注:與正常組比較:#P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別α細(xì)胞(胰高血糖素)β細(xì)胞(胰島素)δ細(xì)胞(生長抑素)PP細(xì)胞(胰多肽)正 常 組 0.367±0.085 0.404±0.048 0.372±0.090 0.328±0.367±0.123 0.075模 型 組 0.483±0.095# 0.266±0.069# 0.475±0.069# 0.415±0.11#津 力 達(dá) 組 0.408±0.047* 0.359±0.070#＊＊ 0.497±0.057# 0.389±0.083羅格列酮組 0.397±0.114＊＊ 0.339±0.081#＊＊ 0.476±0.065#

胰島由4種內(nèi)分泌細(xì)胞組成，其中α、β、δ細(xì)胞間存在緊密連接和縫隙連接，形成具有豐富神經(jīng)和血管聯(lián)系的外周細(xì)胞單元，內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的小分子物質(zhì)可不經(jīng)過細(xì)胞膜而直接轉(zhuǎn)運(yùn)至其他細(xì)胞而發(fā)生相互作用，并在胰島內(nèi)形成自身反饋系統(tǒng)，共同參與血糖調(diào)節(jié)[6]。體內(nèi)血糖調(diào)節(jié)主要取決于α細(xì)胞和β細(xì)胞功能的相互平衡，當(dāng)胰島β細(xì)胞功能障礙引起胰島素分泌絕對或相對不足時(shí)，胰島素對胰高血糖素分泌的抑制作用隨血糖濃度的增加而逐漸減弱[7]，表現(xiàn)為胰島組織內(nèi)α細(xì)胞增生及高胰高血糖素血癥;另一方面胰高血糖素分泌增加刺激δ細(xì)胞增生，引起生長抑素分泌增加，生長抑素通過抑制胰島細(xì)胞對鈣離子的攝取，使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量下降，并以旁分泌形式抑制胰高血糖素和胰島素分泌，其中以對胰高血糖素作用為主[8]。PP細(xì)胞在胰島組織中分布極少，其分泌的胰多肽具有促進(jìn)肝糖原分解、抑制胰酶及胃酸分泌等作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血漿胰多肽水平明顯增高，且胰島PP細(xì)胞存在顯著增生[9]。同時(shí)有研究證實(shí)，減少胰多肽分泌對于改善胰島β細(xì)胞功能具有重要作用[10]。除上述胰島細(xì)胞分泌的激素外，由垂體前葉細(xì)胞分泌的生長激素對血糖調(diào)控同樣發(fā)揮著重要作用。在糖尿病持續(xù)高血糖作用下，由于下丘腦對葡萄糖調(diào)節(jié)反應(yīng)能力下降，導(dǎo)致葡萄糖對生長激素的抑制作用減弱，引起其分泌增加[11]。研究表明，生長激素長期升高將導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰竭及游離脂肪酸增加，從而加重糖代謝紊亂并加速糖尿病及其微血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。綜上，體內(nèi)糖代謝是在胰島及其他血糖調(diào)節(jié)激素等多因素共同參與下完成的，隨著2型糖尿病的發(fā)生，胰島細(xì)胞構(gòu)成及功能明顯變化，同時(shí)由于血糖調(diào)節(jié)激素異常分泌，勢必加重糖尿病糖代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清胰高血糖素、生長激素水平顯著升高，胰島素水平顯著下降，并伴隨胰島內(nèi)胰島素表達(dá)顯著減少，胰高血糖素、生長激素及胰多肽表達(dá)增加，表明模型組胰島β細(xì)胞功能明顯減退，并伴隨α、δ、PP細(xì)胞功能紊亂。運(yùn)用津力達(dá)干預(yù)后血清胰高血糖素、生長激素水平顯著降低，血清胰島素水平升高，同時(shí)增加胰島組織中胰島素表達(dá)并減少胰高血糖素表達(dá)，但對生長抑素及胰多肽作用不明顯。

綜上所述，津力達(dá)顆粒通過調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血清胰島素、胰高血糖素、生長激素等血糖調(diào)節(jié)激素水平，同時(shí)調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞分泌功能，從而改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂。

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