廖 軍，謝巧瑜，張 樂，鄭佳璇，柯玫瑰，黃萍萍

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福州 350122;2.廈門市第二醫(yī)院海滄分院康復(fù)理療科，廈門 361026)

隨著現(xiàn)代生活方式改變，頸椎病發(fā)病率逐年升高，其發(fā)生發(fā)展的根本原因為頸椎間盤退變[1]。大多認(rèn)為，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的降解與基質(zhì)黏附功能減弱導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致頸椎間盤退變的兩個重要因素[2]。一方面，基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶，在椎間盤退變中起重要作用，其中的基質(zhì)金屬蛋白酶-l(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)在椎間盤退變中起關(guān)鍵作用[3];另一方面，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 (Extracellular signal regulated protein kinase，ERK1/2)可促進(jìn)細(xì)胞增殖信號的傳導(dǎo)，故激活ERK1/2信號通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及抑制細(xì)胞凋亡等[4]。此外，ERK1/2信號傳導(dǎo)通路的激活往往可伴有另一通路PI3K-Akt信號通路的激活[5]。蛋白激酶 B(Protein kinaseB，Akt)在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，故Akt、ERK1/2可對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的生長修復(fù)及凋亡有重要影響。對頸椎病的治療西醫(yī)主要有手術(shù)治療和西藥的抗炎鎮(zhèn)痛治療，但手術(shù)影響頸椎結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且費用高、創(chuàng)傷大、西藥治療副作用多等因素，傳統(tǒng)中醫(yī)療法治療頸椎病療效公認(rèn)，捏脊療法治療該病顯示出較好療效[6]。本文研究捏脊療法對頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞影響及其機(jī)制具有重要意義。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD大鼠24只，體質(zhì)量(180±10)g，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、捏脊組、莫比可組，每組6只。動物由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器

一抗(MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt抗體)試劑盒、免疫組化SABC試劑盒(內(nèi)含二抗試劑盒、DAB顯色劑、APES防脫片試劑)，以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，美洛昔康片，購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司(批號H12030241)，切片機(jī)、恒溫干燥箱、石蠟包埋機(jī)。

2 方法

2.1 實驗造模

建立動靜力失衡頸椎病模型，依據(jù)王擁軍等[7]實驗造模。模型組大鼠稱重腹腔麻醉后，在大鼠右側(cè)耳后項背部將鼠毛剔除，常規(guī)消毒，然后在大鼠項背部正中縱向切開長度2 cm左右的切口，再將深群頸夾肌和頭、頸、寰最長肌橫向切斷，切除頸髂肋肌與頭半棘肌，再依次切除右棘上和棘間韌帶，最后縫合。捏脊組、莫比可組造模方法同模型組?？瞻捉M僅消毒切開皮膚后縫合。造模后同等條件、相同時間下飼養(yǎng)2個月。通過HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察椎間盤組織形態(tài)學(xué)情況:空白組頸椎間盤的髓核四周環(huán)繞著纖維環(huán)組織且緊密排列，界限清楚;纖維環(huán)軟骨結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組髓核出現(xiàn)皺縮，髓核與纖維環(huán)間的界限較模糊，髓核有外突趨勢，纖維環(huán)軟骨層纖維部分出現(xiàn)腫脹甚至斷裂，膠原纖維毛糙，軟骨細(xì)胞有退行性改變[8]，確定造模成功。

2.2 治療方法

捏脊組造模后將大鼠用自制的松緊帶固定，每日進(jìn)行1次捏脊治療。捏脊手法:一手固定大鼠，另一手的拇指與食指指腹相對用力，輕輕提起大鼠脊柱兩側(cè)皮膚，從脊中線尾根部一直捏至大椎穴處1次共14次。從第7次開始雙手十指齊捏脊柱兩側(cè)皮膚并捏三提一，從尾根部至大椎穴，力量以大鼠不尖叫且較平靜為度。操作中涉及的穴位按《實驗針灸學(xué)》(李忠仁主編，中國中醫(yī)藥出版社出版)比照人體穴位選取[9]。每日1次，連續(xù)14 d為1個療程，間隔2 d后開始下個療程，共2個療程。

莫比可組造模固定后給予莫比可灌胃治療，按照《動物實驗方法學(xué)》[10]人與大鼠體表面積的藥物等效劑量換算為:大鼠的劑量=人的劑量×(90/100)×(人的體質(zhì)量/大鼠的體質(zhì)量)1/3。每日1次，連續(xù)14 d為1個療程，療程同捏脊組?？瞻捉M、模型組大鼠均固定而不做其他任何處理，治療時間及療程同捏脊組。

2.3 免疫組化檢測

將SD大鼠麻醉處死后于冰袋上快速依次取下各節(jié)椎間盤軟骨組織，用PBS清洗2遍，放入4%多聚甲醛液固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋后進(jìn)行免疫組化操作:先脫蠟，常規(guī)處理至水，于3%H2O2室溫孵育8 min。在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，微波爐加熱至沸騰后將組織放入悶10 min取出，室溫冷卻后用蒸餾水洗1次，PBS洗5 min×3次，再用BSA封閉10 min，稀釋一抗，4℃過夜，將組織取出室溫復(fù)溫1 h后，PBS洗3 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min，PBS洗5 min×3次;滴加試劑SABC20 min，PBS洗3 min×3次;DAB顯色液顯色5 min，顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒，每組隨機(jī)取5只大鼠，每只1張切片，每張切片取400倍視野5個，記錄其陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)取均值，最后蒸餾水洗，未復(fù)染，脫水、透明、封片。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞MMP-1、MMP-3免疫組化的檢測結(jié)果

頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞MMP-1染色結(jié)果顯示，空白組染色較淺，多呈弱陽性或陰性表達(dá)，陽性表達(dá)較少(見圖1);模型組大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞染色普遍較深，黃色、棕褐色較多見，多呈陽性表達(dá)(見圖2);捏脊組、莫比可組多呈陽性或弱陽性(見圖3、圖4)。MMP-3蛋白表達(dá):在空白組陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯較少(見圖5、6);捏脊組、莫比可組陽性細(xì)胞數(shù)量均較模型組少(見圖7、8)。表1顯示，模型組MMP-1、MMP-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);捏脊組與模型組比較，MMP-1、MMP-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示捏脊療法可降低MMP-1、MMP-3蛋白表達(dá)。

表1 大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表達(dá)結(jié)果(s)

表1 大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表達(dá)結(jié)果(s)

注:與模型組比較:△P ＜0.05

組別 例數(shù)MMP-1 MMP-3 ERK1/2 Akt空 白 組 6 24.17±5.23△ 15.50±6.8△ 65.83±14.95△ 96.00±17.02△模 型 組 6 53.3±12.11 49.33±6.64 34.83±11.25 65.50±16.54捏 脊 組 6 26.33±4.89△ 16.17±5.67△ 56.50±18.44△ 88.33±15.77△莫 比 可 組 6 25.33±8.82△ 16.83±6.85△ 58.33±23.54△ 89.67±20.49△

圖1 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-1的免疫組化表達(dá)，×400)

圖2 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-1的免疫組化表達(dá)，×400)

圖3 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-1的免疫組化表達(dá)，×400)

圖4 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-1的免疫組化表達(dá)，×400)

圖5 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-3的免疫組化表達(dá)，×400)

圖6 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-3的免疫組化表達(dá)，×400)

圖7 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-3的免疫組化表達(dá)，×400)

圖8 莫比可組模型組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(MMP-3的免疫組化表達(dá)，×400)

圖9 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(ERK1/2的免疫組化表達(dá)，×400)

圖10 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(ERK1/2的免疫組化表達(dá)，×400)

圖11 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(ERK1/2的免疫組化表達(dá)，×400)

圖12 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(ERK1/2的免疫組化表達(dá)，×400)

圖13 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(Akt的免疫組化表達(dá)，×400)

圖14 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(Akt的免疫組化表達(dá)，×400)

圖15 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(Akt的免疫組化表達(dá)，×400)

3.2 纖維環(huán)細(xì)胞ERK1/2、Akt的免疫組化檢測結(jié)果

ERK1/2、AKT蛋白表達(dá)結(jié)果表明，空白組大鼠纖維環(huán)細(xì)胞均有較多的ERK1/2、Akt蛋白表達(dá)，且顏色較深，多呈強(qiáng)陽性(見圖9、圖13);模型組大鼠纖維環(huán)細(xì)胞顏色較淺，ERK1/2、Akt蛋白表達(dá)較少(見圖10、圖14)。捏脊組、莫比可組多呈弱陽性、陽性(見圖 11、圖12、圖15、16)。圖像分析結(jié)果(見表1)，與空白組比較，模型組ERK1/2、Akt陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，捏脊組ERK1/2、AKT陽性細(xì)胞數(shù)有顯著提高(P＜0.05)，提示捏脊能夠促進(jìn)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞ERK1/2、AKT的蛋白表達(dá)。

圖16 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞(Akt的免疫組化表達(dá)，×400)

4 討論

4.1 頸椎病與捏脊療法

頸椎病屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，頸項部為主要發(fā)病部位。從經(jīng)絡(luò)角度來說，頸椎病發(fā)生與督脈、膀胱經(jīng)關(guān)系密切?！鹅`樞·經(jīng)脈》曰:“督脈之別，名曰長強(qiáng)，挾膂上項，散頭上，下當(dāng)肩胛左右，別走太陽，入貫膂。”督脈為“陽脈之?！?，總督諸陽，頭為諸陽之會，頸項背部屬陽，足太陽膀胱經(jīng)又與督脈旁通，五臟六腑的背俞穴均在膀胱經(jīng)上，二經(jīng)共主諸陽，故督脈與手足三陽經(jīng)及頸項、臟腑經(jīng)脈氣血有密切聯(lián)系。因此二經(jīng)可運行氣血精髓，上可傳輸于腦，下可濡養(yǎng)經(jīng)脈所過之皮肉筋骨等部位;若二經(jīng)經(jīng)氣虛無力升陽，氣血精髓不能上達(dá)頸腦部，即導(dǎo)致頸項部肌肉筋骨腦髓失養(yǎng)，故此二經(jīng)在維持頸項部正常功能有關(guān)鍵作用?，F(xiàn)代研究表明，捏脊療法既可疏調(diào)督脈、振奮陽氣，又可刺激膀胱經(jīng)背部腧穴，以協(xié)調(diào)臟腑功能，使機(jī)體達(dá)到氣血通暢[11]，故捏脊療法可作為通調(diào)二經(jīng)治療頸椎病的重要方法。

4.2 細(xì)胞外基質(zhì)降解與基質(zhì)金屬蛋白酶關(guān)系

在椎間盤中細(xì)胞外基質(zhì)占絕大部分，研究表明細(xì)胞外基質(zhì)的降解可直接導(dǎo)致椎間盤力學(xué)特征喪失，進(jìn)而加速椎間盤退變。Ⅰ、Ⅱ型膠原是椎間盤組織中主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分之一。MMP-1在Ⅱ型膠原降解中起關(guān)鍵的作用，而且其他許多MMPs對Ⅱ型膠原的降解均需通過它起作用。MMP-3不僅能分解聚集性蛋白多糖，也能裂解膠原，激活其他基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[12]。本實驗?zāi)Ｐ徒M椎間盤纖維環(huán)MMP-1、MMP-3的表達(dá)明顯高于空白組，證實MMP-1、MMP-3均參與破壞椎間盤組織結(jié)構(gòu)過程，從而導(dǎo)致椎間盤的退變。

4.3 纖維環(huán)細(xì)胞凋亡與Akt、ERK1/2

頸椎間盤退變的主要發(fā)病因素是軟骨細(xì)胞的凋亡[13]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是整合素介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路的中心分子，是多種信號通路的上游分子，通過ERK將細(xì)胞外信號最終傳遞至胞核，可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、黏附等生物學(xué)行為。研究表明，Integrin/FAK信號通路在椎間盤細(xì)胞凋亡中具有重要調(diào)節(jié)作用，激活I(lǐng)ntegrin/FAK信號通路可激活 ERK1/2，即激活通路 FAK-Ras-MAPK，MAPK信號通路對細(xì)胞的生長與凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用，廣泛存在于各種細(xì)胞中[14]。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，其被激活后，通過磷酸化可抗凋亡分子、激活轉(zhuǎn)錄因子而達(dá)到抗凋亡促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長作用[4]。此外研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號傳導(dǎo)通路的激活可誘導(dǎo)PI-3K被激活，進(jìn)而通過Akt磷酸化一系列下游底物[5]，其中Akt是絲氨酸/酪氨酸家族成員之一，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的分泌，從而抑制軟骨退變、減緩細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，捏脊療法能降低纖維環(huán)細(xì)胞中MMP-1、MMP-3的表達(dá)及提高大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中Akt、ERK1/2的含量以控制椎間盤退變。而MMP-1、MMP-3的表達(dá)減少很可能與細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原分解密切相關(guān);同時Akt、ERK1/2含量的提高是否是通過信號通路 PI-3K-Akt、FAK-Ras-MAPK或其他相關(guān)通路的磷酸化來實現(xiàn)，還需進(jìn)一步研究證實。

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