張可可 連曉怡 鄭金旭 端禮榮

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

特發(fā)性纖維化(IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIP)中最多見的一種疾病。2011年制定的IPF循證醫(yī)學(xué)指南將其定義為：IPF是一種慢性纖維化性間質(zhì)性肺炎，組織學(xué)和(或)胸部高分辨CT特征性表現(xiàn)為普通性間質(zhì)性肺炎(UIP)，病因不明〔1〕。目前臨床上尚無對(duì)IPF有明確療效的治療藥物。研究顯示一氧化氮(NO)是一種有活性的小分子，參與機(jī)體多種生理代謝過程〔2〕。陳磊等〔3〕研究報(bào)道氨基胍(AG)作為誘導(dǎo)性NO合酶(iNOS)抑制劑的干預(yù)作用可以下調(diào)熱休克蛋白47等纖維化因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的大鼠纖維化模型進(jìn)行AG和激素干預(yù)，探討其在肺纖維化中的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠116只，體重(201±18)g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要儀器和試劑為BLM(日本化藥株式會(huì)社)；氨基胍(SIGMA公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(上海通用藥業(yè))；羥脯氨酸測(cè)試盒及NO測(cè)試盒(南京建成生物公司)；ABI7500熒光定量分析儀；Takara SYBR Premix Ex Tag.Eppendorf離心機(jī)。

1.2動(dòng)物分組及模型建立 將116只SD大鼠隨機(jī)分成5組?？瞻讓?duì)照組20只，模型組24只，AG組24只，激素組24只，AG+激素組24只。大鼠稱重，用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，鈍性分離唾液腺，暴露氣管，用注射器注入BLM溶液(5 mg/kg)，然后迅速直立并旋轉(zhuǎn)鼠板。空白對(duì)照組操作同上，氣管內(nèi)注射生理鹽水0.3 ml。建立肺纖維化模型后第2天，AG組每天根據(jù)體重以80 mg/kg AG灌胃，激素組每天根據(jù)體重以3 mg/kg地塞米松腹腔注射，AG+激素組每天根據(jù)體重給予80 mg/kg 灌胃及地塞米松3 mg/kg腹腔注射。空白對(duì)照組及模型組每天注射生理鹽水0.2 ml。分別在7，14，21，28 d每組隨機(jī)處死5只。

1.3標(biāo)本采集 在處死老鼠前，用10%水合氯醛麻醉標(biāo)本。切開頸部暴露氣管，插入靜脈留置針后，冰生理鹽水10 ml，以3、3、4 ml分次注入，回收率超過90%為支氣管肺泡灌洗液(BALF)，冰上放置備用。腹主動(dòng)脈放血法處死老鼠，打開胸腔，分離左右支氣管并結(jié)扎右側(cè)，左側(cè)經(jīng)氣管注入10%甲醛5 ml左右，剪斷左支氣管后投入甲醛固定液。右側(cè)肺葉，簡單剪成小組織塊后分別置于凍存管放入液氮保存。

1.4研究指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1羥脯氨酸測(cè)定 按照試劑盒上的要求進(jìn)行，大概步驟如下：精確稱取右肺組織60～80 mg，加入裂解液后，沸水浴20 min，利用指示劑和pH6.0～6.8加活性碳后離心，取澄清上液1 ml ，加試劑后混勻，再水浴，離心，取上清在550 nm處，測(cè)各管吸光度。

1.4.2BALF中NO測(cè)定 回收BALF低溫離心后，留上清液置于-70℃保存。用硝酸還原法測(cè)NO含量，大致步驟如下：按照試劑盒說明，配置混合試劑，顯色劑和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。在各管中加入相應(yīng)試劑后，37℃水浴，室溫靜置，離心，精確取上清加顯色劑。在550 nm光徑處測(cè)各管吸光度。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA的表達(dá) 取70～90 mg低溫凍存肺組織，用trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。以總RNA為模板，應(yīng)用Thermo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min。取2 μl合成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。由上海生工設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)移生長因子β1的上游引物：5′-aaggtaacgccaggaattgtt-3′，下游引物：5′-geaacaacgcaatctatgaca-3′。β-actin 上游引物：5′-cccatctatgagggt tacgc-3′，下游引物：5′-tttaatgtcacgcacgatttc -3′。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s 1個(gè)循環(huán)，95℃3 s，58℃30 s 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。利用軟件計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參照。

1.5統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 在觀察期內(nèi)BLM組大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少，毛發(fā)失去光澤，肢端發(fā)紺，呼吸急促等現(xiàn)象。于第8、13、20天各死亡1只。AG組在早期7 d同BLM組比較沒有明顯差異，14 d后體重增長好于BLM組。于第4天死亡1只，第19天死亡2只。激素組大鼠在干預(yù)后體重下降明顯，早期就出現(xiàn)毛發(fā)脫落，腹瀉，便血等癥狀。于第12、13、14天各死亡1只，第19天死亡3只，第21天死亡2只。AG+激素組在后期也出現(xiàn)類似激素組的體征。于第17，18天各死亡1只，第20天死亡2只，第22天死亡3只。第28天觀察時(shí)間點(diǎn)由于激素組和AG+激素組大鼠存活只數(shù)低于5，故不納入統(tǒng)計(jì)分析。

2.2BALF中NO的含量變化 7、14 d所有治療組的BALF中NO的含量相比模型組均呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。在21 d及28 d差別無顯著性(P>0.05)。在14 d各組NO均達(dá)到高峰，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)(表1)。

表1 各組肺泡灌洗液中的NO的含量

2.3肺組織羥脯氨酸含量變化 14、21 d所有治療組與模型組比較，羥脯氨酸含量下降趨勢(shì)明顯(P<0.05)。28 d AG組和模型組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

2.4各組TGF-β1 mRNA的表達(dá)變化 模型組及所有治療組的TGF-β1 mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組。7、14 d各治療組TGF-β1 mRNA的表達(dá)均低于模型組(P<0.05)。21、28 d模型和治療組的TGF-β1的表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，AG+激素組和模型組有顯著差異(P<0.05)(表3)。

表2 各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

目前雖然近年認(rèn)為IPF發(fā)病與肺泡上皮細(xì)胞損傷及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和異常修復(fù)有關(guān)〔4～6〕。但具體機(jī)制依然不完全明確。多數(shù)急性加重的IPF患者的治療上主要以糖皮質(zhì)激素和抗纖維化藥物為主，該疾病的自然病程變異很大〔7,8〕。由于免疫抑制劑使用的副作用，其在臨床的使用受到了一定程度的限制。

AG是一種肼復(fù)合物，具有選擇性抑制誘導(dǎo)性iNOS的作用〔9〕。由iNOS產(chǎn)生的NO在BLM誘導(dǎo)的肺泡炎中發(fā)揮重要作用。炎癥因素刺激下，肺泡巨噬細(xì)胞，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)性iNOS表達(dá)增強(qiáng)，NO產(chǎn)量增加〔10〕。

糖皮質(zhì)激素通過抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和纖維細(xì)胞的增生具有抗炎和抗纖維化的作用。但是激素治療的副作用明顯，易發(fā)生免疫抑制，增加樣本的死亡率。AG長期應(yīng)用的毒副作用是否優(yōu)于免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素，目前還不明確。高濃度的NO作為活性氮氧中間產(chǎn)物參與介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，造成組織和細(xì)胞損傷〔11〕。研究報(bào)道AG聯(lián)合厄多司坦對(duì)BLM誘導(dǎo)的鼠肺纖維化有治療作用且優(yōu)于傳統(tǒng)激素治療組〔12，13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚沒有體現(xiàn)此觀點(diǎn)，推測(cè)和AG及激素使用的劑量有關(guān)。羥脯氨酸為膠原纖維所特有，對(duì)羥脯氨酸的測(cè)定可以反映臟器纖維化的程度。NO可以促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，該細(xì)胞是肺纖維化的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制NO的生成可以減輕肺纖維化的程度。

TGF-β1是與臟器纖維化相關(guān)的重要因子〔14～16〕，也是機(jī)體維持正常免疫功能不可缺少的因子，只有TGF-β1過度表達(dá)引起其他細(xì)胞因子高表達(dá)才會(huì)引起纖維化的發(fā)生〔17〕。本文結(jié)果說明AG可以在肺泡炎癥期及炎癥纖維化交替轉(zhuǎn)化期下調(diào)肺TGF-β1 mRNA的表達(dá)，但該作用在纖維化發(fā)展中后期是否仍然有意義，還需進(jìn)一步的研究來闡明。

4 參考文獻(xiàn)

1Raghu G，Collard HR，Egan JJ，etal.An official ATS/ERS/JRS/ALAT/statement：idiopathic pulmonary fibrosis evidence-based guidelines for diagnosis and management〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2011;183(6)：788-824.

2劉凌志，黃之霞，李振華,等.肺間質(zhì)纖維化的患者血清和支氣管肺泡灌洗液一氧化氮水平及臨床意義 〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;29(6)：433-5.

3陳 磊，孫貝貝，文富強(qiáng),等.氨基胍在實(shí)驗(yàn)大鼠肺纖維化中的作用及機(jī)制初探〔J〕.國際呼吸雜志，2008;28(8)：467-70.

4King TE Jr，Pardo A，Selman M，etal.Idiopathie pulmonary fibrosis 〔J〕.Lancet，2011;378(9807)：1949-61.

5管淑紅，鄭金旭，湯 艷,等.Napsin A基因轉(zhuǎn)染干預(yù)A549細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔J〕.解剖學(xué)報(bào)，2011;42(3)：350-5.

6鄭金旭，田京潤，夏德剛,等.Rho激酶-1在肺纖維化小鼠肺組織中的表達(dá)變化與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔J〕.解剖學(xué)報(bào)，2010;41(6)：891-6.

7艾進(jìn)穎，王紅陽,付愛雙，等.博萊霉素致肺纖維化大鼠模型的纖溶變化及低分子肝素的作用 〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2010;38(4)：446-7.

8殷宗寶，王洪武，鄧 超，等.甘利欣對(duì)肺纖維化大鼠的TGF-β1，INF-γ，IL-4的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010；16(8)：182-4.

9羅大衛(wèi)，許 訊.氨基胍與糖尿病視網(wǎng)膜病變〔J〕.眼科新進(jìn)展，2002;22(3)：206-8.

10陳曉琳，李英敏，黃善生,等.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶對(duì)肺纖維化形成的促進(jìn)作用〔J〕.中國病理生理雜志，2001;18(10)：1251-3.

11Saed GM，Abu-soud HM，Diamond MP.Role of nitric oxide in apoptosis of human peritoneal and adhesion fibroblasts after hypoxia〔J〕.Fertil Steril，2004;82(3)：1198-205.

12范龍梅.氨基胍和厄多司坦對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制〔D〕.河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

13陳 寶，李慧萍,范 峰，等.三氧化二砷對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化的影響及其作用機(jī)制〔J〕.中國病理生理雜志，2010;26(5)：858-64.

14Flander KC.Smad3 as a mediator of the fibrotic response〔J〕.Int J Exp Pathol，2004;85(2)：47-64.

15王建平，申玉瑤,楊 燕，等.大鼠肺纖維化過程中TGF-β1和PDGF在不同肺組織中的表達(dá)變化及意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2008;48(23)：26-8.

16楊雅茹，黃 艷，李 俊.TGF-β1介導(dǎo)的Smads與ERK通路在肺纖維化中的作用及相互關(guān)系〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010；26(5)：561-3.

17黃 瑩，葉燕青，孫潔民，等.肺纖維化形成過程中大鼠肺成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1mRNA及HGFmRNA對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2010；10(39)：2548-9.