王碩，喬欣，李蔓，張杰，魏守剛

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069； 2.首都醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，北京 100069)

肥胖與缺鐵性貧血是兒童、青少年中存在的兩個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)健康問題。近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展、人民生活水平的快速提高，我國(guó)的肥胖癥患者已超過9 000萬人，其中兒童肥胖在近15年里增加了28倍，大城市青少年肥胖發(fā)生率已達(dá)11%～15%。缺鐵性貧血是另一種兒童常見疾病，它可降低人體免疫力和活動(dòng)力，還可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成智力損害，嚴(yán)重地影響兒童的健康成長(zhǎng)。

機(jī)體對(duì)膳食鐵的吸收受嚴(yán)密調(diào)控。鐵調(diào)素(hepcidin)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的負(fù)性鐵調(diào)節(jié)因子[7]，可抑制腸道鐵吸收和巨噬細(xì)胞鐵的釋放，導(dǎo)致血循環(huán)鐵降低[8]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，瘦素(leptin)具有調(diào)節(jié)鐵調(diào)素基因表達(dá)的作用[9]，而肥胖患者瘦素水平普遍升高，并且血清瘦素水平與肥胖程度呈正相關(guān)[10]，據(jù)此可推測(cè)肥胖性鐵缺乏可能與瘦素引起鐵調(diào)素含量的變化進(jìn)而導(dǎo)致腸鐵吸收障礙有關(guān)。

本研究通過建立飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型，初步探討肥胖小鼠血循環(huán)鐵調(diào)素含量的變化及與瘦素水平間的關(guān)系，為深入研究肥胖對(duì)鐵代謝的影響提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

建模完成后，用10%水合氯醛0.4 mg·g-1腹腔注射麻醉小鼠，剖開胸腔，心臟穿刺取血，2 000 r·min-1離心15 min，分離血清于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 血清瘦素及鐵調(diào)素含量測(cè)定

血清瘦素及鐵調(diào)素含量的測(cè)定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法，小鼠瘦素ELISA試劑盒、鐵調(diào)素ELISA試劑盒為加拿大HCB公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)操作按說明書進(jìn)行，基本步驟如下：

酶標(biāo)包被板置于室溫下平衡20 min后，將瘦素或鐵調(diào)素標(biāo)準(zhǔn)品液按照濃度次序由低到高各取50 μl(瘦素標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度分別為1.5、1、2、4、8 μg·L-1，鐵調(diào)素標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度分別為1、2、4、8、16 μg·L-1)，分別加入酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔中。在待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，再加待測(cè)樣品10 μl(樣品濃度稀釋5倍)。然后向各標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體100 μl(空白孔不加)，封板膜封孔，將酶標(biāo)板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)輕緩搖動(dòng)下溫育60 min。棄去反應(yīng)液，吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液靜置1 min，棄去洗滌液，吸水紙拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔分別加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液50 μl終止反應(yīng)。在加終止液后15 min內(nèi)測(cè)定各孔吸光度(A)值，利用Anthos 2010酶標(biāo)儀(英國(guó))于450 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品瘦素或鐵調(diào)素濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣品瘦素及鐵調(diào)素實(shí)際含量(μg·L-1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法，P<0.05表示兩變量相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肥胖模型構(gòu)建情況

根據(jù)超重和肥胖評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，一般將體重超過正常體重10%視為超重，超過20%視為肥胖。本研究在完成12周飼養(yǎng)干預(yù)后，對(duì)肥胖模型組共8只小鼠逐一進(jìn)行肥胖度測(cè)評(píng)，測(cè)評(píng)公式：肥胖度(%)=(模型組實(shí)際體重-對(duì)照組平均體重)/對(duì)照組平均體重×100，結(jié)果肥胖模型組有6只小鼠體重超過正常對(duì)照組小鼠平均體重的20%，即6只小鼠肥胖模型建立成功。利用這6只小鼠，并取正常對(duì)照組6只小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.2 肥胖對(duì)血循環(huán)瘦素及鐵調(diào)素含量的影響及其相關(guān)性

肥胖模型組小鼠血液瘦素和鐵調(diào)素含量均顯著高于正常對(duì)照組，其中血瘦素水平在肥胖組和對(duì)照組分別為(33.92±9.39)μg·L-1和(15.32±5.48)μg·L-1(P<0.05)，血鐵調(diào)素分別為(22.51±7.53)μg·L-1和(14.03±1.08)μg·L-1(P<0.05)。以肥胖模型組小鼠的血瘦素含量為橫坐標(biāo)，與其血清鐵調(diào)素含量作散點(diǎn)圖，見圖1。通過統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算相關(guān)系數(shù)r=0.917，P<0.05,表明肥胖小鼠血清鐵調(diào)素水平與瘦素水平之間存在正相關(guān)關(guān)系。

圖1肥胖小鼠血清鐵調(diào)素含量對(duì)瘦素含量散點(diǎn)圖

Fig1Scatterdiagramforserumhepcidinvsleptinconcentrationsinobesemice

3 討 論

研究闡明肥胖通過何種機(jī)制誘發(fā)鐵調(diào)素增高，將對(duì)肥胖性鐵缺乏的有效防治具有指導(dǎo)意義。最近有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瘦素可促進(jìn)肝細(xì)胞鐵調(diào)素基因表達(dá)[9]，而肥胖兒童血液瘦素水平升高并與肥胖度成正比[10]。據(jù)此我們推測(cè)，肥胖者血液鐵調(diào)素增高可能是瘦素介導(dǎo)的，即瘦素是引致肥胖兒童鐵調(diào)素增高的始動(dòng)信號(hào)。為此，本研究檢測(cè)分析了肥胖模型小鼠血液鐵調(diào)素和瘦素水平之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果證明其血循環(huán)鐵調(diào)素水平與瘦素含量顯著正相關(guān)，初步印證了我們的研究假設(shè)，即：肥胖將首先引起體內(nèi)瘦素水平增高，瘦素繼而刺激鐵調(diào)素的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致肥胖者血循環(huán)鐵調(diào)素水平升高;后者通過抑制其靶組織腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)入血，終致發(fā)生肥胖性鐵缺乏或缺鐵性貧血。但本研究?jī)H先期提供了肥胖小鼠體內(nèi)瘦素與鐵調(diào)素水平相關(guān)關(guān)系的證據(jù)，更充分的研究證據(jù)尚待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)觀察。

瘦素通過其受體發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。瘦素在體內(nèi)作用的一大特點(diǎn)是存在瘦素抵抗，主要表現(xiàn)為受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻[14]。事實(shí)上，肥胖者血液瘦素水平增高主要就是瘦素抵抗導(dǎo)致的代償性分泌增加，但瘦素抵抗并非瘦素的全部生物學(xué)效應(yīng)一致減弱，而是呈現(xiàn)一定的效應(yīng)選擇性[15]。如上所述，瘦素被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)鐵調(diào)素基因表達(dá)的作用，但在肥胖并瘦素抵抗情況下小鼠所表現(xiàn)出的鐵調(diào)素水平增高，是否仍為瘦素直接作用的結(jié)果，抑或是選擇性瘦素抵抗效應(yīng)的一種體現(xiàn)，更或是存在其它體內(nèi)作用機(jī)制，有待深入研究闡明。

[11] SANAD M,OSMAN M，GHARIB A.Obesity modulate serum hepcidin and treatment outcome of iron deficiency anemia in children:a case control study[J].Ital J Pediatr，2011，37:34.