李曉榮，張美俊，楊武德，馮美臣，武志明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 山西 太谷 030801)

Bt棉功能葉氮代謝對(duì)Bt蛋白表達(dá)及氮肥調(diào)節(jié)的響應(yīng)

李曉榮，張美俊，楊武德，馮美臣，武志明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 山西 太谷 030801)

為評(píng)價(jià)外源Bt基因插入以及氮肥對(duì)Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)及氮代謝的影響，對(duì)Bt棉功能葉Bt蛋白含量，硝酸還原酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和蛋白酶活性，可溶性蛋白質(zhì)和全氮含量等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：Bt棉功能葉Bt蛋白含量在蕾期最高，此后，隨生育進(jìn)程呈顯著下降。與常規(guī)棉相比，Bt棉功能葉硝酸還原酶活性提高，在前中期谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著提高且有利于可溶性蛋白質(zhì)的合成，前期全氮含量顯著增加，對(duì)蛋白酶活性沒有明顯影響。Bt棉功能葉Bt蛋白含量與硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)和全氮含量呈顯著正相關(guān)，表明Bt棉前期增強(qiáng)的氮代謝促進(jìn)了Bt蛋白的表達(dá)。施氮肥明顯提高Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和Bt蛋白的表達(dá)。基施和初花期各50%的效應(yīng)顯著大于全部基施，而在基施氮肥基礎(chǔ)上，初花期增施50%的氮肥效應(yīng)最明顯。與常規(guī)棉比較，施氮肥更有利于Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量提高。

Bt棉；Bt蛋白；氮代謝；氮肥

國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織ISAAA報(bào)道，2011年全球轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達(dá)2470萬(wàn)hm2，占全球棉花總種植面積的68.6%，其中Bt抗蟲棉是應(yīng)用和種植的主要貢獻(xiàn)品種。我國(guó)自1997年Bt棉投入生產(chǎn)種植以來(lái)，其種植面積迅速擴(kuò)增，2011年我國(guó)Bt棉種植面積達(dá)390萬(wàn)hm2，占棉花總種植面積的71.5%[1]。對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物，由于體細(xì)胞無(wú)性系變異，外源基因插入受體基因組區(qū)位的隨機(jī)性和不確定性以及基因間的互作，可導(dǎo)致活性基因的修飾或沉默以及沉默基因的激活，進(jìn)而可能導(dǎo)致新的代謝物形成或改變?cè)写x物的水平(速率)[2～4]。

田間試驗(yàn)表明，與其受體品種相比，Bt棉新棉33前期出苗慢、幼苗素質(zhì)差[5]。Bt棉GK-12結(jié)鈴性增強(qiáng)，單株果枝數(shù)、單株果節(jié)數(shù)、棉鈴長(zhǎng)度、棉鈴體積、棉鈴經(jīng)濟(jì)系數(shù)、鈴重均下降，棉鈴?fù)庑斡蓤A錐形突變?yōu)槁褕A形，鈴柄長(zhǎng)度大幅度增加[6]。田曉莉等[7]發(fā)現(xiàn)，Bt棉中棉30的單株葉面積、葉面積系數(shù)和側(cè)根數(shù)量較輪回親本中棉16大幅度降低，但結(jié)鈴性強(qiáng)且?guī)旎钚愿撸虼嗽磶?kù)關(guān)系失調(diào)，容易早衰。劉微等[8]以克螟稻1號(hào)及其對(duì)照親本秀水11為材料，分析了Bt基因?qū)λ竟夂咸匦约肮夂袭a(chǎn)物積累的影響，認(rèn)為外源Bt基因的導(dǎo)入對(duì)溫室種植條件下水稻葉片光合特性具有短暫影響，但這種影響不具有持續(xù)性?？嗣?號(hào)大多數(shù)碳代謝指標(biāo)的顯著變化主要是由無(wú)性系變異引起的[9]。Bt蛋白的表達(dá)是氮素合成Bt蛋白的氮代謝過(guò)程，作為氮代謝過(guò)程的一部分，外源蛋白表達(dá)如何引發(fā)植株自身在氮代謝方面產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)還不確定[4]。氮素是Bt作物Bt蛋白的主要成分之一[10]，因此，氮素的供應(yīng)同樣會(huì)影響B(tài)t蛋白表達(dá)。Alinia等[11]研究認(rèn)為，隨施氮量的增加，Bt水稻Bt蛋白表達(dá)量將隨之增加。Bruns和Abel[12]研究也表明，增加氮肥供應(yīng)量，相應(yīng)地增加了Bt玉米葉片中Bt蛋白表達(dá)量。因此，從與Bt基因表達(dá)Bt蛋白密切相關(guān)的氮代謝著手，研究Bt基因插入后Bt棉氮代謝生理強(qiáng)度的變化及施氮對(duì)Bt棉Bt蛋白表達(dá)和氮代謝的影響，可為生產(chǎn)上合理調(diào)節(jié)Bt棉Bt蛋白穩(wěn)定表達(dá)和氮代謝平衡提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試Bt棉分別為Bt冀668及晉棉26，親本對(duì)照分別為常規(guī)棉冀668和晉棉7。Bt冀668和晉棉26均是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將Bt基因(Cry1Ac)導(dǎo)入各自對(duì)照常規(guī)棉而選育的Bt棉品種。種子均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2012-2013年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田和農(nóng)學(xué)院生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)和氮代謝變化試驗(yàn)設(shè)計(jì)：供試棉花品種為Bt棉Bt冀668及晉棉26，親本常規(guī)棉為冀668和晉棉7。以品種為試驗(yàn)因子，田間按單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每品種重復(fù)5次，共計(jì)20個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積3.5 m× 7.5 m，行距75 cm，株距15 cm。試驗(yàn)地土壤為黃土母質(zhì)上發(fā)育而成的石灰性褐土，其養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)12.84 g·kg-1，全氮0.86 g·kg-1，速效磷6.47 mg·kg-1，速效鉀176.34 mg·kg-1。氮肥施用量300 kg·hm-2，氮肥用尿素，施過(guò)磷酸鈣600 kg·hm-2、氯化鉀 300 kg·hm-2，全部以基肥施入。4月20日種子經(jīng)催芽后采用地膜覆蓋穴播，每穴4粒種子，三葉定苗，其他田間管理按常規(guī)進(jìn)行。分別于棉花苗期(7葉期，6月4日)、蕾期(6月21日)、花期(7月16日)、盛鈴期(8月14日)、吐絮期(9月15日)，取棉株功能葉倒4葉，打頂后取倒2葉。每一小區(qū)每一生育期隨機(jī)選取15株棉葉。一部分鮮樣用于硝酸還原酶(NR)活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定；一部分樣液氮冷凍后用于Bt蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性、蛋白酶活性的測(cè)定；其余樣70℃烘干用于全氮含量的測(cè)定。

氮肥對(duì)Bt棉中后期功能葉Bt蛋白表達(dá)和氮代謝的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)：供試棉花品種為Bt棉晉棉26和親本常規(guī)棉晉棉7。試驗(yàn)采用直徑為35 cm，高為30 cm的聚乙烯塑料盆進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每盆裝土20 kg。采用地表2 m以下的生土，為黃土母質(zhì)上發(fā)育而成的石灰性褐土，其養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)4.56 g·kg-1，全氮0.097 g·kg-1，速效磷3.86 mg·kg-1，速效鉀75.41 mg·kg-1。設(shè)置不同的氮肥施用方式，分別為0.3125 g·kg-1土(全部基施)、0.3125/0.156 g·kg-1土(基施/初花期追施)、0.156/0.156 g·kg-1土(基施/初花期追施)以及CK 0 g·kg-1土。KH2PO40.2425 g·kg-1土以基肥一次施入。初花期追施的氮肥溶于水后澆入桶中，所用氮肥為尿素。每品種每處理重復(fù)12次，共96個(gè)盆。4月25日種子經(jīng)催芽后播種，三葉定苗，每盆留苗一株，其他管理按田間常規(guī)進(jìn)行。于棉株盛花期(7月25日)、盛鈴期(8月16日)每處理隨機(jī)選取6盆，取棉株功能葉倒4葉，打頂后取倒2葉。一部分鮮樣用于可溶性蛋白質(zhì)和硝酸還原酶活性的測(cè)定；一部分樣液氮冷凍后用于Bt蛋白的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

Bt棉功能葉Bt蛋白含量采用ELISA試劑盒(購(gòu)置于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化控中心，其中包括被包被抗體的96孔板及配套試劑)進(jìn)行測(cè)定[13]。

棉株功能葉硝酸還原酶活性的測(cè)定采用磺胺比色法[14]，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定采用比色法[14]，蛋白酶活性的測(cè)定采用比色法[14]，可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[14]，全氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或Duncan新復(fù)極差多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)

由表1可見，2個(gè)Bt棉功能葉Bt蛋白含量均表現(xiàn)蕾期最高，苗期次之，從蕾期開始隨生育進(jìn)程呈顯著下降趨勢(shì)。Bt冀668功能葉Bt蛋白含量在生育前中期(苗期、蕾期和花期)顯著高于晉棉26。表明不同Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)有所不同，但均表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主階段功能葉Bt蛋白含量顯著增加，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，開始顯著下降。

表1 不同生育期Bt棉功能葉Bt蛋白含量/μg·g-1(M±SD)

注：同列標(biāo)有* 或同行Bt棉不同生育期字母不同表示差異顯著(plt;0.05)。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column; The different small letters mean significant difference at the 0.05 level in the same line.

2.2 Bt棉功能葉硝酸還原酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和蛋白酶活性變化

硝酸還原酶是氮素同化過(guò)程的第一個(gè)酶，硝酸還原酶對(duì)棉株體內(nèi)外因素反應(yīng)靈敏，被稱為限速酶，其數(shù)量和活力對(duì)NO3-還原具有重大效應(yīng)[16]。由表2可以看出，Bt棉功能葉硝酸還原酶活性在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和常規(guī)棉變化一致，苗期到蕾期活性增強(qiáng)，隨后開始逐漸下降。但相同生育期功能葉NR活性，Bt棉和對(duì)照常規(guī)棉存在一定差異。除吐絮期外，其余生育期均表現(xiàn)Bt棉顯著提高了功能葉NR活性，且在蕾期和花期增幅最大，Bt冀668增幅分別為40.28%和36.99%，晉棉26增幅分別為44.62%和32.28%。這表明Bt基因的插入提高了Bt棉功能葉NR活性，對(duì)N素還原能力增強(qiáng)。

表2 不同生育期棉株功能葉硝酸還原酶活性/μg·g-1·h-1(M±SD)

注：同列標(biāo)有* 表示Bt棉與各自對(duì)照常規(guī)棉有差異(plt;0.05)。 表3、表5和表6同。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column between Bt cotton and conventional cotton, respectively. The same as table 3, 5, 6.

谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要參與氨基交換，形成植物體內(nèi)的多種氨基酸。轉(zhuǎn)氨基作用和氨基酸的合成主要在葉片中進(jìn)行，因而葉片中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化可以直接反映棉株的氮素同化的基本特征。表3表明，2個(gè)Bt棉功能葉谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化為生長(zhǎng)前期逐漸增強(qiáng)，到花期后開始逐漸降低，而2個(gè)常規(guī)棉谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨生長(zhǎng)發(fā)育一直增強(qiáng)到盛鈴期后，才開始有所下降，且2個(gè)Bt棉谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均在花期以前顯著高于2個(gè)常規(guī)棉，這說(shuō)明Bt基因插入后Bt棉氨基交換過(guò)程發(fā)生了變化，在前中期功能葉氨基酸合成能力顯著增強(qiáng)，后期減弱早于常規(guī)棉。

表3 不同生育期棉株功能葉谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性/μmol·g-1·min-1(M±SD)

蛋白酶參與蛋白質(zhì)分解的過(guò)程，產(chǎn)生的氨基酸用于新蛋白質(zhì)的合成或進(jìn)一步降解氧化、轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。由表4可見，無(wú)論Bt棉還是常規(guī)棉，功能葉蛋白酶活性均在前中期較低，逐漸增強(qiáng)到盛鈴期達(dá)高峰后有所降低。2個(gè)Bt棉與各自對(duì)照常規(guī)棉整個(gè)生育期功能葉蛋白酶活性均無(wú)顯著差異。這一結(jié)果表明，Bt基因的插入對(duì)Bt棉功能葉蛋白質(zhì)分解代謝沒有產(chǎn)生顯著影響。

表4 不同生育期棉株功能葉蛋白酶活性/mg·g-1·h-1(M±SD)

2.3 Bt棉功能葉可溶性蛋白質(zhì)和全氮含量變化

表5顯示，2個(gè)Bt棉和2個(gè)常規(guī)棉功能葉可溶性蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致，在蕾期含量達(dá)到最高后開始逐漸下降。在生長(zhǎng)前中期(苗期、蕾期和花期)2個(gè)Bt棉顯著提高了功能葉可溶性蛋白質(zhì)含量，且在蕾期增幅最大，Bt冀668增幅為21.09%，晉棉26增幅為25.42%。結(jié)合Bt棉對(duì)功能葉蛋白酶活性的研究結(jié)果表明，Bt棉在生長(zhǎng)前中期蛋白質(zhì)的合成能力明顯提高。

表5 不同生育期棉株功能葉可溶性蛋白質(zhì)含量/mg·g-1(M±SD)

表6表明，Bt棉和常規(guī)棉功能葉全氮含量變化一致，苗期和蕾期功能葉全氮含量較高，這和田曉莉等盛蕾期之前是棉株一生中氮代謝最活躍的時(shí)期的結(jié)論是一致的[17]，以后全氮含量呈下降趨勢(shì)。2個(gè)Bt棉功能葉全氮含量在生長(zhǎng)前期(苗期和蕾期)顯著高于2個(gè)常規(guī)棉，Bt冀668平均增幅達(dá)26.94%，晉棉26達(dá)28.30%。

表6 不同生育期棉株功能葉全氮含量/g·kg-1(M±SD)

注：同列標(biāo)有* 表示Bt棉與各自對(duì)照常規(guī)棉有差異(plt;0.05)。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column between Bt cotton and conventional cotton, respectively.

2.4 Bt棉功能葉Bt蛋白與氮代謝指標(biāo)相關(guān)性分析

Bt棉功能葉Bt蛋白含量在蕾期達(dá)最高，吐絮期降到整個(gè)生育期最低值，且與常規(guī)棉相比，Bt棉蕾期功能葉氮代謝指標(biāo)大多數(shù)有顯著改變，而吐絮期變化較少，為探明Bt棉氮代謝對(duì)Bt蛋白表達(dá)的響應(yīng)，對(duì)Bt棉蕾期和吐絮期功能葉各項(xiàng)氮代謝指標(biāo)與Bt蛋白含量進(jìn)行相關(guān)分析。由表7可以看出，功能葉Bt蛋白含量在蕾期和吐絮期均與硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量以及全氮含量呈顯著正相關(guān)，與其他氮代謝指標(biāo)相關(guān)性較差。

表7 Bt棉功能葉Bt蛋白和氮代謝指標(biāo)相關(guān)系數(shù)

注：*表示顯著相關(guān)(plt;0.05).

Note： * means significant correlation at the 0.05 level.

2.5 氮肥對(duì)Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)的影響

表8顯示，施氮肥Bt棉功能葉Bt蛋白含量在盛花期和盛鈴期顯著高于不施氮處理，表明施氮肥可顯著提高Bt棉中后期功能葉Bt蛋白的表達(dá)。初花期增施氮肥比基施又有顯著提高，其中以基施基礎(chǔ)上再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1處理)功能葉Bt蛋白含量達(dá)最高，在盛花期、盛鈴期分別是不施氮處理的2.32、4.34倍，比單基施氮肥(0.3124 g·kg-1處理)分別增幅39.58%、67.24%。施氮肥Bt棉功能葉Bt蛋白含量從盛花期到盛鈴期下降的幅度均小于不施氮處理，如從盛花期到盛鈴期施氮肥0.3124、0.3124/0.156、0.156/0.156 g·kg-1下降幅度分別為65.52%、38.14%、48.20%，而對(duì)照為158.21%。

表8 氮肥對(duì)Bt棉晉棉26功能葉Bt蛋白含量的影響/μg·g-1(M±SD)

注：同一列字母不同的表示有差異(plt;0.05)

Note：The different small letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

2.6 氮肥對(duì)Bt棉功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量的影響

由表9可見，施氮肥Bt棉在盛花期和盛鈴期功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量均比不施氮肥顯著提高，表明充足的氮素供應(yīng)可顯著提高Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量，基施和初花期各50%的效應(yīng)顯著大于全部基施，在基施基礎(chǔ)上，在初花期再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1處理)提高最明顯。同一施氮處理，Bt棉功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量均顯著高于常規(guī)棉，Bt棉施氮較不施氮功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量增加的幅度也均高于常規(guī)棉增加的幅度，如硝酸還原酶活性，施氮肥0.3124/0.156 g·kg-1Bt棉在盛花期和盛鈴期增加幅度分別為49.64%和90.74%，常規(guī)棉增加的幅度分別為42.67%和68.22%，可溶性蛋白含量, 施氮肥0.3124/0.156 g·kg-1Bt棉在盛花期和盛鈴期增加幅度分別為40.69%和74.54%，而常規(guī)棉增加的幅度分別為29.86%和37.37%，顯示增施氮肥更有利于Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量提高。

表9 氮肥對(duì)棉株功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量的影響(M±SD)

注：同一列字母不同的表示差異顯著(plt;0.05)

Note：The different small letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

3.1 Bt棉功能葉氮代謝對(duì)Bt蛋白表達(dá)的響應(yīng)

試驗(yàn)結(jié)果表明， Bt棉功能葉在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主階段Bt蛋白含量顯著增加，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，顯著下降。這與前人研究Bt棉Bt蛋白在棉花不同生育期的表達(dá)具有時(shí)間特性是一致的[13,18,19]。棉株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中心向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，蕾花鈴對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的需求量逐漸增加，抑制了葉片中Bt蛋白的合成[20]。有研究表明，隨轉(zhuǎn)Bt棉生育期的推進(jìn)，在生育后期，Bt基因的表達(dá)減弱，葉片中將基因轉(zhuǎn)換成Bt蛋白的RNA幾乎全部喪失，植株不能繼續(xù)產(chǎn)生Bt蛋白，導(dǎo)致其含量下降[21]。因此尋求促進(jìn)中后期葉片Bt蛋白表達(dá)量增加的措施，對(duì)于增強(qiáng)Bt棉的中后期抗蟲性具有重要意義。

試驗(yàn)結(jié)果表明，Bt棉功能葉硝酸還原酶活性提高，在前中期谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著增強(qiáng)，說(shuō)明Bt基因插入更有利于氮素的還原和同化。Bt棉功能葉蛋白酶活性沒有發(fā)生顯著變化，顯著提高了功能葉可溶性蛋白質(zhì)含量，前期顯著提高了全氮含量，這表明Bt基因插入后，Bt棉在生長(zhǎng)前中期蛋白質(zhì)的合成能力明顯提高。孫彩霞等[4]對(duì)Bt棉苗期氮代謝研究表明，與非轉(zhuǎn)基因棉花相比，苗期Bt棉Z30葉片內(nèi)氮素的同化和蛋白質(zhì)的水解過(guò)程沒有明顯改變,而氨基交換過(guò)程可能發(fā)生改變，推測(cè)苗期Bt棉體內(nèi)的Bt蛋白的表達(dá)量較低，因而其對(duì)植株氮代謝特征影響也較小，建議對(duì)Bt棉各生育期的氮代謝特征進(jìn)行研究。田間條件下Bt棉的氮代謝較強(qiáng)，葉片全氮含量明顯升高，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高，葉片硝酸還原酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增強(qiáng)，蛋白酶活性則明顯下降[22]，本研究結(jié)果與此研究結(jié)果基本一致。

Bt蛋白的表達(dá)就是氮素合成蛋白的氮代謝過(guò)程，董志強(qiáng)等[23]研究表明，Bt棉33B的氮代謝特征影響了其Bt蛋白的表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示功能葉Bt蛋白與硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量以及全氮含量呈顯著正相關(guān)，與前人研究Bt棉體內(nèi)Bt蛋白表達(dá)量與氮代謝水平呈顯著正相關(guān)[24～27]一致，表明增強(qiáng)的氮代謝有利于Bt蛋白的表達(dá)。Bt棉主莖幼葉、功能葉和衰老葉片中硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，認(rèn)為Bt棉主莖葉片中硝酸還原酶活性和葉片可溶性蛋白的合成量密切相關(guān)，即葉片硝酸還原酶調(diào)控著可溶性蛋白的合成量[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明Bt棉蕾期和吐絮期功能葉硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量也呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.781(r0.05=0.632)和0.749。結(jié)合本試驗(yàn)硝酸還原酶活性和Bt蛋白的顯著相關(guān)關(guān)系，可以推測(cè)硝酸還原酶活性顯著影響可溶性蛋白質(zhì)和Bt蛋白的合成量。試驗(yàn)結(jié)果還表明，蕾期Bt冀668功能葉硝酸還原酶活力為18.84 μg·g-1·h-1，相當(dāng)于吐絮期活力的2.60倍，可溶性蛋白含量和Bt蛋白含量分別是吐絮期的2.26倍和3.93倍，因此推測(cè)Bt棉中后期Bt蛋白表達(dá)量的下降與中后期硝酸還原酶活性減弱和可溶性蛋白含量降低密切相關(guān)。

3.2 氮肥對(duì)Bt棉功能葉Bt蛋白表達(dá)及氮代謝的調(diào)節(jié)

當(dāng)施氮肥時(shí)，Bt作物可利用的氮隨之增加，Bt蛋白合成酶和mRNA的數(shù)量可能會(huì)大量增加，因此將會(huì)有大量的Bt蛋白被合成[12]。研究表明在合理的施用率范圍內(nèi)，施氮肥可顯著提高Bt棉中后期(盛花期和盛鈴期)功能葉Bt蛋白的表達(dá)，使中后期Bt蛋白含量下降幅度減少，從而有利于中后期抗蟲性的增強(qiáng)。氮肥運(yùn)籌為基施和初花期各50%的效應(yīng)顯著大于全部基施，而在基施氮肥基礎(chǔ)上，初花期增施50%的氮肥效應(yīng)最明顯，表明整個(gè)生育期充足的氮肥供應(yīng)顯著提高功能葉Bt蛋白的表達(dá)。Pettigrew等[20]的研究也表明盡管不同的氮肥處理由于產(chǎn)量構(gòu)成因素之間的不同，導(dǎo)致在皮棉產(chǎn)量上最終沒有形成顯著差異，但相同氮肥基施量下，后期增施50 %的氮肥使葉片Bt蛋白含量提高了14%。

氮肥是生產(chǎn)上可以調(diào)節(jié)的一個(gè)栽培措施，氮素營(yíng)養(yǎng)充足，棉葉各代謝過(guò)程增強(qiáng)[28]，開花期追施適量氮肥，在一定程度上可以改善棉葉光合性能，維持硝酸還原酶活性，使生育葉片后期維持較高生理活性[29]，馬宗斌等[30]研究表明氮肥施用方式(氮肥分施比例)會(huì)影響B(tài)t棉氮代謝。高氮素營(yíng)養(yǎng)有利于Bt棉的硝酸還原酶活性的提高，但這一點(diǎn)在親本棉上沒有明顯表現(xiàn)出來(lái)。在高氮素水平處理下，Bt棉的氮素代謝較親本棉花旺盛[31]。本研究也得出類似的結(jié)果。研究表明施氮肥明顯提高Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量，與常規(guī)棉比較，增施氮肥更有利于Bt棉中后期功能葉硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量提高?；┖统趸ㄆ诟?0%的效應(yīng)顯著大于全部基施，在基施基礎(chǔ)上，在初花期再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1處理)提高最明顯。氮肥施用量和施用方式可顯著改變Bt棉功能葉氮代謝水平，因此，生產(chǎn)中可通過(guò)氮肥調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)Bt棉氮代謝和提高Bt棉中后期抗蟲性。

[1]CLIVE J.2011 年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國(guó)生物工程雜志,2012,32(1):1-14.

[2]CONNER A J,Jacobs J M E.Genetic engineering of crops as potential source of genetic hazard in the human diet [J].Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,1999,443:223-234.

[3]FIM R D,Jones C G.Secondary metabolism and the risks of GMOS [J].Nature,1999,400:13-14.

[4]孫彩霞,張麗莉,吳瓊,等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉苗期氮代謝[J].生態(tài)學(xué)雜志,2007,26(2):187-191.

[5]秦新敏,于風(fēng)玲,宋燕青,等.新棉33B生物學(xué)特性及配套栽培技術(shù)[J].中國(guó)棉花,2000,27(5):37-38.

[6]劉劍光,肖松華,狄佳春,等.Bt基因?qū)雽?duì)棉花農(nóng)藝性狀的影響[J].中國(guó)棉花,2003,30(3):15-17.

[7]田曉莉,楊培珠,王保民,等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉源器官的建成及其功能[J].棉花學(xué)報(bào),2003,15(2):91-96.

[8]劉微,王樹濤,陳英旭,等.轉(zhuǎn)Bt(Cry1Ab)基因?qū)λ竟夂咸匦约肮夂袭a(chǎn)物積累的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(3):627-633.

[9]王偉博,崔海瑞,盧美貞,等.轉(zhuǎn)Bt基因水稻的碳代謝特性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(8):1564-1570.

[10]張順,陳剛,房衛(wèi)平,等.施氮量對(duì)抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)和降解的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2011,26(6):148-153.

[11]ALINIA F B,Ghareyazie L,Rubia J,et al.Effect of plant age,larval age,and fertilizer treatment on resistance of cry1Ab-transformed aromatic rice to lepidopterous stem borers and foliage feeders[J].Journal of Economic Entomology,2000,93:484-493.

[12]BRUNS H A,Abel C A.Nitrogen fertility effects on Bt δ-endotoxin and nitrogen concentrations of maize during early growth[J].Agronomy Journal,2003,95:207-211.

[13]王保民,李召虎,李斌,等.轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉各器官毒蛋白的含量及表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2002,10(3):215-219.

[14]張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2003:41-154.

[15]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2010:30.

[16]李文才,林振武,湯玉瑋.硝酸還原酶的研究Ⅶ.棉花不同品種的硝酸還原酶活力[J].作物學(xué)報(bào),1986,12(2):95-99.

[17]田曉莉,楊培珠,王保民,等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉中棉所30的碳、氮代謝特征[J].棉花學(xué)報(bào),2000,12(4):172-175.

[18]束春娥,孫洪武,孫以文,等.轉(zhuǎn)基因棉Bt毒性表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)及對(duì)棉鈴蟲生存、繁殖的影響[J].棉花學(xué)報(bào),1998,10(3):131-135.

[19]孫偉,曹玉洪.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉Bt毒蛋白表達(dá)量的時(shí)空變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(2):202-203.

[20]PETTIGREW W T,Adamczyk J J Jr.Nitrogen fertility and planting date effects on lint yield and Cry1Ac(Bt) endotoxin production[J].Agronomy Journal,2006,691-697.

[21]張少燕,張寶喻.轉(zhuǎn)基因棉花Bt毒蛋白的表達(dá)及其生態(tài)效應(yīng)[J].昆蟲知識(shí),2002,39(5):328-335.

[22]陳后慶,劉燕,張祥,等.Bt轉(zhuǎn)基因棉氮代謝生理變化的研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(4):20-24.

[23]董志強(qiáng),何鐘佩,翟學(xué)軍.轉(zhuǎn)Bt基因棉新棉33B葉片氮素代謝特征及其化學(xué)調(diào)控潛力[J].棉花學(xué)報(bào),2000,12(3):113-117.

[24]張祥,馬愛麗,房靜,等.赤霉酸和縮節(jié)胺對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉棉鈴Bt毒蛋白表達(dá)及氮代謝的影響[J].棉花學(xué)報(bào),2010,22(2):150-156.

[25]吉榮龍,崔必波,黃志勇,等.源庫(kù)調(diào)節(jié)對(duì)Bt棉棉鈴?fù)庠礆⑾x蛋白表達(dá)量影響的研究[J].棉花學(xué)報(bào),2011,23(5):454-459.

[26]姜周庚,張延昭,馮夢(mèng)詩(shī),等.高溫脅迫對(duì)盛鈴期Bt棉棉鈴中殺蟲蛋白表達(dá)量及氮代謝的影響[J].中國(guó)棉花,2012,39(4):13-15.

[27]張明偉,繆軍,顧超,等.低溫高濕對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉殺蟲蛋白表達(dá)及其氮代謝的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(9):218-221.

[28]楊長(zhǎng)琴,徐立華,楊德銀.氮肥對(duì)抗蟲棉Bt蛋白表達(dá)的影響及其氮代謝機(jī)理的研究[J].棉花學(xué)報(bào),2005,17(4):227-231.

[29]王樹安.作物栽培學(xué)總論[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1994:386.

[30]馬宗斌,嚴(yán)根土,劉桂珍,等.氮肥分施比例對(duì)黃河灘地棉花葉片生理特性、干物質(zhì)積累及產(chǎn)量的影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2013,19(5):1092-1101.

[31]高慧璟,肖能文,李俊生,等.不同氮素水平下CO2倍增對(duì)轉(zhuǎn)Bt棉花氮素代謝的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志,2009,28(11):2213-2219.

ResponseofNitrogenMetabolisminFunctionalLeaftoBtProteinExpressionandNitrogenFertilizerAdjustmentforBtCotton

Li Xiaorong, Zhang Meijun, Yang Wude, Feng Meichen, Wu Zhiming

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

To investigate the effect of Bt gene and N fertilizer on Bt protein and nitrogen metabolism of functional leaf of Bt cotton, Bt protein content, nitrate reductase (NR) activity, glutamic-pyruvic transaminase (GPT) activity, protease activity, soluble protein content and total N content of functional leaf were measured in this study. The results showed that Bt protein content in functional leaf of Bt cottons reached the highest at budding stage. From then on, Bt protein content reduced significantly. Compared with conventional cottons, the NR activity of functional leaf of Bt cottons was enhanced, also the GPT activity and soluble protein content was increased significantly before flowering stage, and the total nitrogen content was increased significantly before budding stage, while there was no significant effect on protease activity. There was a significant positive correlation between Bt protein content and NR activity, soluble protein content and total nitrogen content. It concluded that the enhanced nitrogen metabolism at early stage promoted the Bt protein expression. N fertilizer improved Bt protein expressing, NR activity and soluble protein content of functional leaf of Bt cotton at middle and later stages. 50% of N fertilizer respectively at the basal and the early flowering stages affected much more than that of N fertilizer at all the basal stage. And on all basis N fertilizer, the effect of increasing 50% of the nitrogen fertilizer application at early flowering stage was the most significant. Compared with conventional cotton, N fertilizer was more helpful for the increasing of NR activity and soluble protein content of functional leaf for Bt cotton at middle and later stages.

Bt cotton; Bt protein; Nitrogen metabolism; N fertilizer

2014-03-20

2014-05-16

李曉榮(1990-), 女(漢), 陜西延安人，在讀碩士,研究方向: 作物生態(tài)。

張美俊, 博士,副教授。Tel:0354-6288982;E-mail: meijunz@126.com

山西省自然科學(xué)基金(2012011030-2)

S183

A

1671-8151(2014)04-0301-07

(編輯：馬榮博)