李娜娜 邵文韻 劉 暢 陸建良 梁月榮

(浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江杭州 310058)

類胡蘿卜素是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類色素，是含有多個(gè)共軛雙鍵的萜烯類化合物，在植物生命中發(fā)揮重要作用，具有捕獲光能，消除氧自由基的光保護(hù)功能，同時(shí)為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑脫落酸及其他激素類物質(zhì)合成提供底物［1－2］。類胡蘿卜素各組分的顏色具有差異性，在非綠色組織內(nèi)，積累某些獨(dú)特的成分，植株器官所呈現(xiàn)出來(lái)的顏色也不相同，如無(wú)色的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素，淺黃色的ζ-胡蘿卜素，橙黃色的鏈孢紅素，紅色的番茄紅素，黃色的葉黃素，橘黃色的 β-胡蘿卜素［1］。

八氫番茄紅素脫氫酶(EC:1.3.5.5，phytoene desaturase，PDS)是類胡蘿卜素生物合成途徑(pathway:map00906)中的關(guān)鍵限速酶之一，催化八氫番茄紅素(phytoene)兩步脫氫轉(zhuǎn)化為ζ-胡蘿卜素。PDS基因的突變和抑制性表達(dá)，會(huì)大量積累八氫番茄紅素，減弱葉綠素、類胡蘿卜素和赤霉素的生物合成，植株呈現(xiàn)白化和矮化的外在表型［3］;當(dāng)含有PDS基因片段的重組質(zhì)粒病毒侵染植物后誘導(dǎo)靶基因沉默，由于PDS的mRNA表達(dá)受到抑制，侵染發(fā)病的植物葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象［4－7］。

‘黃金芽’由白化突變新梢培育而成，全年白化，葉片黃色，是新型光照敏感型茶樹(shù)品種，成品茶具有氨基酸含量高、滋味鮮爽、香氣悠長(zhǎng)等優(yōu)良品質(zhì)特征［8－10］。為探究PDS基因是否是‘黃金芽’產(chǎn)生白化現(xiàn)象的關(guān)鍵調(diào)控因子，本實(shí)驗(yàn)利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)和 RT-PCR技術(shù)，克隆獲得茶樹(shù)八氫番茄紅素脫氫酶的全長(zhǎng)基因，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)［11－12］，分析比較PDS基因在正常綠色茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’、黃色白化突變品種‘黃金芽’及遮蔭處理‘黃金芽’中的表達(dá)變化，同時(shí)該基因的獲得也為利用基因工程手段調(diào)控茶樹(shù)類胡蘿卜素物質(zhì)的生物合成打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’、‘黃金芽’、30%遮蔭度‘黃金芽’及60%遮蔭度‘黃金芽’的新梢一芽二葉，采自浙江省杭州市富陽(yáng)茶園，取樣后迅速用液氮冷凍處理，然后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 采用Trizol法(裂解液購(gòu)自 TaKaRa公司，Code No.9109)提取總RNA，方法步驟參照文獻(xiàn)［13］。以提取所得茶樹(shù)總 RNA為模板，Oligo dT為引物，按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa公司，Code No.6110A)操作說(shuō)明書(shū)合成cDNAD第一鏈。

1.2.2 PDS 基因 3'端序列(3'RACE)和 5'端序列(5'RACE)的獲得 根據(jù)已發(fā)表八氫番茄紅素脫氫酶中間序列(GenBank:EU275984.1)，利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。3'RACE特異性引物:5'-TGCTATTGAAGGAGATGCCTATG-3'，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小 900 bp;5'RACE特異性引物:5'-ACCTAGAATTGCTGGAATGAGTCC-3'，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小950 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

3'端序列的操作步驟依次按照3'-Full RACE Core Set Ver 2.0 試劑盒(TaKaRa Code:D314)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。②套式PCR反應(yīng)，包括Outer PCR和Inner PCR反應(yīng)。取20 μl Inner PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收目的片段，保存于－20℃。

5'端序列的獲得采用5'-Full RACE Kit試劑盒(TaKaRa Code:D315)進(jìn)行套式PCR反應(yīng)。①去磷酸化處理。使用alkaline phosphatase(CIAP)對(duì)Total RNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)。②“去帽子”反應(yīng)。使用 tobacco acid pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。③5'RACE adaptor的連接。④反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。⑤套式PCR反應(yīng)，包括Outer PCR和Inner PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取20 μl PCR反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并切割膠回收目的片段，保存于－20℃。

1.2.3 目的片段克隆及測(cè)序 使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 3.0 試劑盒(TaKaRa Code:D823A)從切割的瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段，接著將DNA片段插入進(jìn)T載體，采用PMD?18-T Vector試劑盒(TaKaRa Code:D101A)。將10 μl DNA 連接液與50 μl冰浴融化的Trans 109(TransGen，Lot#F141012)感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴和熱激之后加入940 μl液體LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。離心后吸取適量體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含有0.1 mg/ml氨芐青霉素、0.024 mg/ml 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、0.04 mg/ml X-Gal的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選白色單菌落接種于0.1 ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，采用菌液PCR法確認(rèn)陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆液送至上海英濰捷(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.2.4 CsPDS生物信息學(xué)分析 利用 ExPASy的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序，計(jì)算蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)，包括相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、正負(fù)電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等;使用 ExPASy的 ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性/疏水性分析;采用 SOPMA程序(http://pbil.univ-lyon1.fr/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);利用 SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;使用 ChloroP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP);采用 PSORT(http://www.psort.org/)程序，進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);利用ExPASy 的 TMpred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域;使用NCBI的blastx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì);采用ClustalX軟件、GeneDoc軟件和MEGA 5.05軟件，進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.5 CsPDS實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 使用 NCBI Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)程序，在線設(shè)計(jì)CsPDS引物，引物序列為 F:5'-AAGGACGTGTGCCCTTTGAA-3'，R:5'-CTGCACCAGCAATGACAACC-3'，產(chǎn)物大小為 154 bp。以β-Actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物序列為F:5'-CTTCCTCATGCTATCCTCCGTCTT-3'，R:5'-ATTT CCCGTTCAGCAGTGGTG-3'，產(chǎn)物大小為 113 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

使用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa Code:DRR420A)試劑進(jìn)行熒光定量PCR。在熒光定量PCR管中加入上游引物和下游引物各0.4 μl(引物濃度為 20 μmol/L)，滅菌蒸餾水 6.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM10 μL，cDNA 模板 2 μL，ROX Reference Dye 0.4 μl(熒光校正)，總反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。采用兩步法，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)讀取由 ABI Stepone PlusTMReal-Time PCR System自動(dòng)完成，使用公式方法來(lái)計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)葉片總RNA的提取

提取的茶樹(shù)葉片總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用 GeneQuant RNA/DNA Calculator比色測(cè)定其濃度和純度。圖1可見(jiàn)，所提取的總RNA樣品28 S和18 S條帶清晰完整，且28 S的條帶亮度大于18 S;OD260/OD280值為1.6～1.9之間。說(shuō)明總RNA的質(zhì)量良好，沒(méi)有發(fā)生降解并且無(wú)基因組污染，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 PDS基因3'端和5'端序列的擴(kuò)增

根據(jù)茶樹(shù)PDS基因已知中間序列和TaKaRa 3'RACE試劑盒原理設(shè)計(jì)引物，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，3'端特異性引物和 3'RACE Outer Primer、Inner Primer進(jìn)行兩次擴(kuò)增得到產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)900 bp目的條帶(圖2)。根據(jù)茶樹(shù)PDS基因已知中間序列和TaKaRa 5'RACE試劑盒原理設(shè)計(jì)引物，接頭RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，5'端特異性引物和5'RACE Outer Primer、Inner Primer進(jìn)行兩次擴(kuò)增得到產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)950 bp目的條帶(圖3)。

圖2 PDS基因3'末端擴(kuò)增結(jié)果

2.3 CsPDS基因序列生物學(xué)分析

利用ExPASy的ProtParam程序計(jì)算蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)，結(jié)果顯示，CsPDS的分子量為64.86 KDa，理論等電點(diǎn)為6.77，含量豐富的氨基酸有亮氨酸(Leu)10.0%、丙氨酸(Ala)7.7%、賴氨酸(Lys)7.2%、纈氨酸(Val)7.2%，帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為68，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)為67，不穩(wěn)定指數(shù)38.50，此蛋白質(zhì)穩(wěn)定(不穩(wěn)定指數(shù) ＜40，蛋白質(zhì)穩(wěn)定)。

圖3 PDS基因5'末端擴(kuò)增結(jié)果

使用 ExPASy的 ProtScale程序，采用 Hphob./Kyte＆Doolittle的方法，對(duì)CsPDS蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析，結(jié)果如圖4所示，最大值2.522，最小值 －2.844，總平均親水性為 －0.163。根據(jù)正值越大，疏水性越高;負(fù)值越小，親水性越高來(lái)判斷，表明CsPDS為親水性蛋白。SOPMA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，CsPDS具有占39.35%的α-螺旋(229個(gè)氨基酸)、占4.47%的β-轉(zhuǎn)角(26個(gè)氨基酸)、占39.35%的無(wú)規(guī)則卷曲(229個(gè)氨基酸)和占16.84%的延伸鏈(98個(gè)氨基酸)。

圖4 CsPDS的親水性/疏水性預(yù)測(cè)

利用SignalP 4.1 Server程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，該蛋白質(zhì)為非分泌蛋白;利用ChloroP 1.1 Server程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)，結(jié)果表示，該基因蛋白質(zhì)序列含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，且cTP前導(dǎo)序列長(zhǎng)度58。利用 ExPASy的PSORT程序?qū)Φ鞍讈喖?xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)，CsPDS具有在葉綠體類囊體膜中的可能性。通過(guò)TMpred程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，該蛋白具有2個(gè)明顯的跨膜螺旋，在氨基酸第110～129和239～256區(qū)域，說(shuō)明CsPDS編碼的蛋白是跨膜蛋白質(zhì)。分析可知，CsPDS為細(xì)胞核基因編碼，在葉綠體類囊體膜上發(fā)揮作用的酶蛋白。

圖5 CsPDS蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用NCBI的blastx程序，對(duì)該基因核苷酸序列進(jìn)行蛋白同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與許多植物的PDS氨基酸序列都有較高的同源性(表1)，其中與柿子(Diospyros kaki)、葡萄(Vitis vinifera)、杏(Prunus armeniaca)、煙草(Nicotiana attenuata)最為接近，相同度分別為87%、84%、84%和83%。對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其保守區(qū)具有NAD_binding_8特殊位點(diǎn)，屬于NAD_binding_8 Superfamilies超家族基因。

表1 茶樹(shù)CsPDS氨基酸序列在NCBI中blastx結(jié)果

利用 ClustalX 1.81軟件、GeneDoc軟件和MEGA 5.05軟件，選擇和茶樹(shù)CsPDS親緣性較近的幾個(gè)物種的PDS氨基酸序列作多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析。結(jié)果表明(圖6)，茶樹(shù)與其他植物的PDS序列具有許多高度保守區(qū)域，以黑色和灰色方框表示，顏色越深，保守度越高。采用 MEGA 5.05軟件的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，構(gòu)建茶樹(shù)與柿樹(shù)等15種植物的PDS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖7)，茶樹(shù)PDS與柿樹(shù)(Diospyros kaki)、葡萄(Vitis vinifera)等的親緣關(guān)系相近，但與菊花(Chrysanthemum)、臘梅(Chimonanthus praecox)等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 茶樹(shù)CsPDS氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的多序列比對(duì)

2.4 CsPDS基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖8)，CsPDS基因在‘黃金芽’內(nèi)表達(dá)量顯著高于正常茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’(2.86倍)，30%遮蔭率可以使其表達(dá)上調(diào)，60%遮蔭率條件下表達(dá)量與自然光照下無(wú)明顯差異。遮蔭能減弱光照強(qiáng)度，‘黃金芽’葉色由黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色［14］。分析可見(jiàn)，CsPDS基因的表達(dá)并沒(méi)有隨著光照強(qiáng)度的減弱而持續(xù)上調(diào)，且在突變體內(nèi)的表達(dá)量高于正常植株。

3 討論

茶樹(shù)功能基因的分離和克隆是茶樹(shù)生物技術(shù)研究的重要內(nèi)容之一，是茶樹(shù)基因表達(dá)分析和種質(zhì)資源遺傳改良的重要工作基礎(chǔ)［15］。本實(shí)驗(yàn)從茶樹(shù)中克隆CsPDS基因cDNA序列含有1749 bp的完整開(kāi)放閱讀框，生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的氨基酸序列與其他植物有較高的同源性，保守區(qū)域具有NAD(P)結(jié)合特殊位點(diǎn)，多序列比對(duì)得出CsPDS與

圖7 基于NJ法的不同植物PDS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

不同物種之間氨基酸序列的保守域基本相同。因此，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)克隆獲得的CsPDS是八氫番茄紅素脫氫酶，為分析該基因的表達(dá)及利用基因工程手段調(diào)控茶樹(shù)類胡蘿卜素類物質(zhì)代謝提供可能。

圖8 CsPDS在不同茶樣品中的表達(dá)情況

‘黃金芽’是新梢葉片呈現(xiàn)黃色白化現(xiàn)象的茶樹(shù)突變體，成品茶品質(zhì)獨(dú)特，氨基酸含量高［8－10，14］，但抗逆性相對(duì)較弱，對(duì)外界光照強(qiáng)度甚是敏感，夏季強(qiáng)光照易使白化葉片灼傷焦枯［8，16］。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用‘黃金芽’種質(zhì)資源及改進(jìn)其栽培管理技術(shù)，需要研究該品種的分子遺傳白化機(jī)理。八氫番茄紅素脫氫酶是催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)進(jìn)入類胡蘿卜素生物合成途徑的第二反應(yīng)步驟，［17］利用病毒誘導(dǎo)PDS基因沉默，PDS表達(dá)受到抑制，植物會(huì)出現(xiàn)明顯的黃化［18－19］或高度均勻的光漂白［20］表型。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析的結(jié)果說(shuō)明，CsPDS在‘黃金芽’體內(nèi)的表達(dá)沒(méi)有受到顯著抑制，甚至明顯高于正常綠色茶樹(shù)品種的表達(dá)量，說(shuō)明‘黃金芽’的黃色白化現(xiàn)象不是PDS基因抑制性表達(dá)而引起，其白化表型遺傳機(jī)理有待進(jìn)一步的調(diào)查研究。

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