鮑俊杰 鄒 勇 陳小紅 張白杜

1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗科，廣東廣州 510180；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院輸血科，廣東廣州 510630

同種異體輸血可導(dǎo)致免疫功能抑制，一旦發(fā)生免疫抑制，人體更易受到細(xì)菌、病毒和腫瘤的侵襲，臨床上通常表現(xiàn)為術(shù)后較高的細(xì)菌感染發(fā)生率和惡性腫瘤復(fù)發(fā)率[1-3]。目前關(guān)于同種異體輸血導(dǎo)致的免疫抑制的機制仍不明確，已有報道顯示同種異體輸血能夠抑制自然殺傷（NK）細(xì)胞的功能[4-8]。本研究通過分析β重型地中海貧血兒童NK細(xì)胞的表達(dá)頻率及殺傷活性，旨在探討長期輸血對β重型地中海貧血兒童NK細(xì)胞細(xì)胞頻率及殺傷活性的影響，為重型β地中海貧血兒童臨床免疫監(jiān)測和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年1月～2013年12月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心及中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行輸血治療長達(dá)3年的β重型地中海貧血兒童20例為β重型地中海貧血組，其中男13例，女7例，年齡（9.90±4.87）歲。排除貧血以外的其他疾病如細(xì)菌、病毒性感染、腫瘤等。選取同期同齡健康體檢兒童20例作為對照組，男 11例，女 9例，年齡（10.80±5.92）歲。 所有患者及患者家屬均知情同意。

1.2 儀器與試劑

BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀 （美國BD公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、APC標(biāo)記的鼠抗人CD56、PE標(biāo)記的鼠抗人CD107a、鼠抗人lgG1同型對照抗體、紅細(xì)胞裂解液、阻斷劑GolgiStop均購自美國BD公司；刺激劑佛波酯（PMA）、鈣離子導(dǎo)入劑伊屋諾霉素（Ionomycin）購自美國Sigma公司，人淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物。

1.3 研究方法

1.3.1 NK細(xì)胞比例分析 取100 μL無菌外周抗凝血，加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、APC標(biāo)記的鼠抗人CD56單克隆抗體各20 μL,室溫閉光孵育30 min，紅細(xì)胞裂解液室溫裂解15 min后用流式緩沖液離心洗滌兩次，500 μL流式緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2 NK細(xì)胞CD107a表達(dá)分析 密度梯度離心無菌分離外周血單個核細(xì)胞 （PBMC）,將PBMC用完全1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL，置于24孔板，加入刺激劑 PMA（20 ng/mL），Ionomycin（1 μg/mL），PE標(biāo)記的鼠抗人CD107a或同型對照抗體20 μL。1 h避光刺激后加入阻斷劑GolgiStop，繼續(xù)孵育5 h。加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、APC標(biāo)記的鼠抗人CD56單克隆抗體各20 μL,室溫閉光孵育30 min后用流式緩沖液離心洗滌2次，500 μL流式緩沖液重懸， 流式細(xì)胞儀檢測 NK細(xì)胞 （CD3－CD56+） 表面CD107a表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（M）及四分位數(shù)（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞細(xì)胞頻率

結(jié)果顯示：與對照組比較，β重型地中海貧血組外周血 NK 細(xì)胞頻率顯著減少[（4.5±2.8）%比（12.0±4.0）%]，差異有統(tǒng)高度計學(xué)意義（P=0.000）。 見圖 1。

2.2 NK細(xì)胞殺傷活性（CD107a）表達(dá)

圖1 NK細(xì)胞細(xì)胞頻率圖

結(jié)果顯示：β重型地中海貧血組外周血NK細(xì)胞表面 CD107a表達(dá)頻率為（23.9±7.4）%，對照組為（51.4±11.9）%，β重型地中海貧血組外周血NK細(xì)胞的殺傷活性顯著低于對照組，差異有統(tǒng)高度計學(xué)意義 （P=0.000）。 見圖 2。

3 討論

β地中海貧血是我國華南一帶尤其在廣西、廣東省發(fā)病率最高危害最大的遺傳病之一[9]。2007年的一項不完全統(tǒng)計顯示，廣州市β地中海貧血的發(fā)生率為11.26%，其中β地中海貧血（輕型，中間型）發(fā)生率為10.0%，β重型地中海貧血發(fā)生率為1.26%[10]。重型地中海貧血患兒的出生和地中海貧血基因的蔓延，已經(jīng)嚴(yán)重影響了人口出生的質(zhì)量，為社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟和心理負(fù)擔(dān)。

圖2 NK細(xì)胞殺傷活性（CD107a）表達(dá)分析圖

重型β地中海貧血的兒童需要以每3～4周1次的頻率接受長期的輸血治療才能維持生命，然而長期的貧血狀態(tài)以及大量輸血增加了機體鐵負(fù)荷，常導(dǎo)致患者自身免疫功能低下，易引起呼吸道感染等各種并發(fā)癥及臟器功能損害、壽命縮短等[11-12]。大量研究已經(jīng)證實同種異體輸血可以導(dǎo)致免疫功能的抑制，而且許多學(xué)者認(rèn)為，輸血誘導(dǎo)的免疫抑制是多種機制共同作用的結(jié)果。目前關(guān)于輸血導(dǎo)致的免疫抑制的機制仍不能確定，已經(jīng)報道的有以下幾種：①同種異體輸血刺激了受血者的免疫系統(tǒng)，使Th1反應(yīng)（細(xì)胞免疫）下調(diào)，Th2反應(yīng)（體液免疫）上調(diào)[13]；②患者輸入的異體血中單核細(xì)胞分泌的前列腺素 E2（PGE2）增加[14]，PGE2有強烈的免疫抑制作用，減少了巨噬細(xì)胞HLA-Ⅱ類抗原的表達(dá)，抑制了白介素-2（IL-2）的產(chǎn)生，使得靶細(xì)胞對IL-2的反應(yīng)性下降，Th1反應(yīng) （細(xì)胞免疫）下調(diào)，自然殺傷細(xì)胞（NK）活性下降，B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的水平下調(diào)；③輸血能夠抑制NK細(xì)胞的功能。因此本研究組也推測長期輸血的β重型地中海貧血兒童的固有免疫系統(tǒng)特別是NK的功能可能受到了抑制。

本研究分析了β重型地中海貧血組NK細(xì)胞（CD3－CD56+） 的表達(dá)頻率及殺傷活性 （CD107a表達(dá)），發(fā)現(xiàn)其外周血NK細(xì)胞頻率及殺傷活性均顯著低于對照組，此可能與輸血誘導(dǎo)的NK細(xì)胞免疫抑制相關(guān)，其機制有待進(jìn)一步深入研究。目前本研究組推測可能的NK細(xì)胞免疫抑制的分子機制有：①長期輸血導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD8+Treg）的抑制功能增強，分泌的IL-10和TGF-β增加，NK細(xì)胞功能受到抑制；②懸浮紅細(xì)胞在保存過程中由于白細(xì)胞的崩解，產(chǎn)生的可溶性HLA-Ⅰ類抗原、FasL和TGF-β的產(chǎn)物增加，輸注后對NK細(xì)胞的功能起到一定的抑制作用；③異體血中的活性物質(zhì)如PGE2、TGF-β、IL-10等或可溶性免疫介質(zhì)HLA-Ⅰ類抗原、FasL等誘使受血者NK細(xì)胞表面NK細(xì)胞受體表達(dá)紊亂，活化型受體表達(dá)下調(diào)或抑制型受體上調(diào)，導(dǎo)致NK細(xì)胞傳導(dǎo)的抑制信號占優(yōu)，NK細(xì)胞功能受到抑制?？傊M(jìn)一步研究長期輸血β地中海貧血兒童輸血誘導(dǎo)的NK細(xì)胞免疫抑制的分子機制是下一步工作的重點，此將為β地中海貧血兒童臨床免疫監(jiān)測和免疫干預(yù)治療提供重要的分子靶點和理論基礎(chǔ)。

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