潘倩倩 朱夢靈 劉 洋 林 燊 李仁輝

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

近年來, 水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴(yán)重, 國內(nèi)外許多湖泊相繼發(fā)生藍(lán)藻水華現(xiàn)象。許多水華藍(lán)藻種類還能產(chǎn)生藍(lán)藻毒素和釋放異味物質(zhì)嚴(yán)重破壞水環(huán)境和生態(tài)[1—3]。資料顯示, 世界各地不同水域發(fā)生的藍(lán)藻水華中有 25%—70%可以檢測到藍(lán)藻毒素,并且水華藍(lán)藻種類中約有 60%為產(chǎn)毒藍(lán)藻[4]。其中微囊藻毒素(Microcystins, 簡稱 MCs)是最常見的肝毒素, 主要由微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、項(xiàng)圈藻(Anabaenopsis)、浮絲藻(Planktothrix)和念珠藻(Nostoc)等藍(lán)藻種類產(chǎn)生[5]。

浮絲藻作為常見的產(chǎn)微囊藻毒素種類而被廣泛關(guān)注, 其在國內(nèi)外特別是歐洲國家水體中分布廣泛[6—9]。Rantala, et al.研究發(fā)現(xiàn), 浮絲藻是除微囊藻之外最常見的潛在產(chǎn)微囊藻毒素的種類[10]。除微囊藻毒素之外, 浮絲藻還能夠產(chǎn)生魚腥藻毒素-a(Anatoxin-a)、麻痹性貝類毒素(Paralytic shellfish poisoning toxins, 簡稱PSTs)等多種藍(lán)藻毒素[11,12]。目前阿氏浮絲藻與粉紅浮絲藻(Planktothrix rubescens)的微囊藻毒素合成基因簇已全部測序并注釋完成[13,14]。阿氏浮絲藻P. agardhii CYA 126/8的微囊藻毒素合成基因簇測序全長約55.6 kb, 包括9個(gè)功能基因, 其中8個(gè)基因(mcyA, -B, -C, -D, -E, -G, -H和-J)與微囊藻的微囊藻毒素合成基因相似。但是被命名為 mcyT的基因是浮絲藻所特有的編碼硫酯酶的基因, 位于浮絲藻微囊藻毒素合成基因簇的 5′末端, 并且其轉(zhuǎn)錄方向與其他基因均相反[13]。mcyT基因編碼產(chǎn)物硫酯酶與 mcyC基因編碼產(chǎn)物硫酯酶結(jié)構(gòu)域相互輔助共同參與微囊藻毒素的合成過程。Christiansen, et al.推測可能由于浮絲藻含有mcyT基因可以編碼除 McyC之外的第二種硫酯酶, 而在微囊藻中缺失該基因, 從而導(dǎo)致浮絲藻 Planktothrix CYA 126的微囊藻毒素含量高于微囊藻 M. aeruginosa PCC 7806 和 K139[13]。

在我國, 浮絲藻也是常見水華藍(lán)藻種屬, 常與其他水華藍(lán)藻如微囊藻、魚腥藻等共存, 并且也有浮絲藻占優(yōu)勢的藍(lán)藻水華現(xiàn)象[13,15]。胡鴻鈞等報(bào)道過阿氏浮絲藻(Planktothrix agardhii)等3個(gè)種[16], 林燊等基于分子系統(tǒng)學(xué)研究報(bào)道過阿氏浮絲藻、假阿氏浮絲藻(Planktothrix pseudagardhii)和蒙氏浮絲藻(Planktothrix mougeotii)等種類[17]。目前我國對(duì)產(chǎn)毒微囊藻研究較多, 其他潛在產(chǎn)微囊藻毒素的藍(lán)藻研究較少, 而浮絲藻作為分布廣泛的潛在產(chǎn)毒水華藍(lán)藻種類需要引起關(guān)注。本文通過PCR擴(kuò)增方法檢測分離自我國不同省份水體的阿氏浮絲藻的微囊藻毒素合成酶基因來初步探討我國浮絲藻的產(chǎn)毒情況。選取微囊藻毒素合成相關(guān)的多肽合成酶基因mcyA、聚酮合成酶基因 mcyE以及硫酯酶基因 mcyT進(jìn)行PCR檢測。鑒于歐洲水體中, mcyT基因廣泛存在于產(chǎn)毒浮絲藻與不產(chǎn)毒浮絲藻中, 并且其側(cè)翼區(qū)存在一定的多樣性[18], 所以我們對(duì)浮絲藻的 mcyT基因進(jìn)行序列擴(kuò)增測序, 并通過構(gòu)建分子系統(tǒng)樹分析我國浮絲藻 mcyT基因的序列多樣性, 為后續(xù)進(jìn)一步研究我國浮絲藻和其他水華藍(lán)藻種類的產(chǎn)毒情況提供參考, 也為有害藍(lán)藻的監(jiān)測和治理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的13株阿氏浮絲藻分別來自北京、上海、浙江、湖北、云南和新疆等地, 這些藻株均為單種藻株, 保存于中國科學(xué)院水生生物研究所有害藻類學(xué)科組藻種庫(CHAB), 藻株的編號(hào)及來源見表1。實(shí)驗(yàn)所用藻株均由CT完全培養(yǎng)基[19]靜置培養(yǎng),每日早晚手動(dòng)搖勻使之不貼壁生長, 光照強(qiáng)度為25 μmol/(m2·s), 光暗周期為 12h︰12h, 溫度為(25±1)℃。

1.2 藻株基因組DNA提取

參考 Xanthogenate-SDS(XS)DNA抽提方法[20],并作適當(dāng)改變用于提取藻株的基因組DNA。方法如下: 取約10 mL對(duì)數(shù)生長期的浮絲藻藻液(根據(jù)藻液密度具體情況而定)于12000 r/min離心5min, 棄上清, 將藻泥轉(zhuǎn)至2 mL離心管, 每管依次加入TER緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4; 1 mmol/L EDTA,pH 8; 100 mg/mL RNase A)100 μL, 置于生物樣品均質(zhì)儀(MasterPrep, China)中細(xì)胞破碎6.5 m/s 60s重復(fù)2次, 液氮凍融1次。然后每管再依次加入XS buffer[1% potassium ethyl xanthogenate (Fluka, Buchs,Switzerland); 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4; 20 mmol/L EDTA, pH 8; 1% sodium dodecylsulfate; 800 mmol/L ammonium acetate] 750 μL, 充分混勻, 70℃水浴2h, 其間震蕩混勻數(shù)次, 冰浴30min。13000 r/min 4℃冷凍離心20min, 取上清于新的2 mL離心管, 加入等體積的異丙醇, 混勻, 室溫放置 10min, 然后13000 r/min室溫離心 20min, 緩慢倒掉上清, 再加入 1 mL 70%冰乙醇清洗沉淀, 12000 r/min離心15min, 緩慢倒掉乙醇, 50℃真空干燥 30min, 最后加入50 μL無菌雙蒸水溶解, 置于–20℃待用。

表1 13株阿氏浮絲藻的藻株信息Tab. 1 13 strains of Planktothrix agardhii investigated in this srudy

1.3 浮絲藻微囊藻毒素合成酶基因的 PCR檢測、測序及分子系統(tǒng)分析

對(duì)本研究的13株阿氏浮絲藻藻株進(jìn)行PCR檢測, 選用微囊藻毒素合成相關(guān)的多肽合成酶基因mcyA、聚酮合成酶基因mcyE以及硫酯酶基因mcyT,擴(kuò)增引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成, 詳細(xì)信息見表2。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 包含200 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2、1×buffer PCR 緩沖液、10 pmol引物、1 U Taq DNA聚合酶(Takara, Japan)。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性 5min; 94℃變性 30s,55℃ (F1/R4)、56℃ (mcyE-F2/mcyE-R4)、59℃ (mcyACd 1F/mcyA-Cd 1R)、60℃ (mcyTA-Z+/mcyTA-Z–)退火30s, 72℃延伸1min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的片段產(chǎn)物通過膠回收試劑盒回收(BioFlux)。將回收產(chǎn)物連接到載體 pMD18-T (Takara, Japan)上, 然后克隆載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E. coli DH5α (Takara,Japan)中, 挑取單克隆菌液送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

測序得到的序列通過 NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì),并將本研究獲得的序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)基因序列用Clustal X1.83軟件進(jìn)行對(duì)位排列整理。然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件 MEGA 5.0基于 Kimura two-parameter模型構(gòu)建鄰接法分子系統(tǒng)關(guān)系樹(Neighbor-Joining tree, 簡稱NJ tree), 步展值(bootstrap value)設(shè)置為1000, 空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對(duì)刪除(Pairwise deletion)處理。

2 結(jié)果

2.1 浮絲藻的微囊藻毒素合成酶基因檢測

13株浮絲藻的微囊藻毒素合成酶基因檢測結(jié)果見表1, 從表中可以發(fā)現(xiàn), mcyA和mcyE基因均沒有檢測到目的產(chǎn)物, 只有 mcyT基因序列有目的擴(kuò)增片段。mcyT基因序列PCR擴(kuò)增電泳圖見圖1。其中編號(hào) CYA126/8代表作為陽性對(duì)照的產(chǎn)毒浮絲藻 P.agardhii CYA126/8[16]的mcyT基因序列擴(kuò)增片段。

2.2 浮絲藻16S rRNA基因及mcyT基因序列分子系統(tǒng)分析

PCR擴(kuò)增得到浮絲藻CHAB 235及CHAB 643的16S rRNA基因序列全長1452 bp (序列號(hào)見表1),其余藻株的序列參考林 燊等的研究結(jié)果[17], 將這13株浮絲藻的16S rRNA基因序列與GenBank中相似序列進(jìn)行序列比對(duì)整理, 截取最大可使用的序列長度約 1371 bp, 以 Planktothricoides raciborskiiNSLA3為外類群構(gòu)建NJ樹, 得到結(jié)果如圖2所示。該分子系統(tǒng)樹分為兩大分支, 其中第 I簇主要為阿氏浮絲藻, 第 II簇主要為粉紅浮絲藻藻株序列, 本實(shí)驗(yàn)所用13株浮絲藻均位于第I簇。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物信息列表Tab. 2 Primers used in this study

圖1 浮絲藻mcyT 基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis result for testing mcyT gene of planktothrix

圖2 基于16S rRNA基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹(節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表1000重復(fù)Bootstrap值的百分?jǐn)?shù), 低于50%的未顯示)Fig. 2 Phylogenetic tree (NJ) based on 16S rRNA sequences (The numbers at each node represent the percentage of bootstrap setting as 1000, only showing those above 50%)

PCR擴(kuò)增得到的13株浮絲藻mcyT序列長度為703 bp(序列已上傳至GenBank, 序列號(hào)見表1)。通過NCBI BLAST比對(duì), 結(jié)果顯示均與GenBank中的阿氏浮絲藻的mcyT序列相似度最高, 達(dá)到99%。將這13株浮絲藻的mcyT序列與GenBank上下載的浮絲藻的序列經(jīng)比對(duì)及對(duì)位排列整理, 以 Nostoc sp.PCC 7120編碼硫酯酶基因序列為外類群, 構(gòu)建關(guān)于mcyT序列的分子系統(tǒng)樹, 得到結(jié)果如圖3所示。該分子系統(tǒng)樹分為兩大分支, 本研究中的13株阿氏浮絲藻位于第I分支, 并且第I分支中除這13株藻株之外的其他序列均來自不產(chǎn)微囊藻毒素的阿氏浮絲藻; 而第II分支中所有序列均來自產(chǎn)微囊藻毒素的阿氏浮絲藻和粉紅浮絲藻, 兩分支之間的最低相似度分別為99.1%和98.5%, 這說明基于mcyT序列的分子系統(tǒng)樹可以將產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒的阿氏浮絲藻區(qū)分開來。我們通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)我國不產(chǎn)毒浮絲藻與國外產(chǎn)毒阿氏浮絲藻的序列存在一定的堿基差異, 其差異處如圖 4所示, 從圖中可以看出產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒浮絲藻的堿基差異沒有一個(gè)固定的區(qū)間, 只是零散的分布于該序列中, 而正是這些差異使得浮絲藻的 mcyT序列呈現(xiàn)一定的多樣性, 從而在分子系統(tǒng)樹中將產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒浮絲藻區(qū)分開來。

3 討論

圖3 基于mcyT基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹(節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表1000重復(fù)Bootstrap值的百分?jǐn)?shù), 低于50%的未顯示)Fig. 3 Phylogenetic tree (NJ) based on mcyT sequences (The numbers at each node represent the percentage of bootstrap setting as 1000,only showing those above 50%)

圖4 浮絲藻的部分mcyT基因序列(黑色方框代表差異位點(diǎn))Fig. 4 Partial sequence alignment of the mcyT gene from strains of Planktothrix species (The box represents the variable sites)

在歐洲, 浮絲藻是一種常見產(chǎn)微囊藻毒素的絲狀水華藍(lán)藻, 其中阿氏浮絲藻和粉紅浮絲藻是歐洲水體中最常見的兩種浮絲藻種類, 兩者可分別占據(jù)不同生境水域的優(yōu)勢地位[17]。粉紅浮絲藻一般出現(xiàn)在分層、貧營養(yǎng)或中營養(yǎng)的深水湖泊, 而阿氏浮絲藻則分布更為廣泛, 常與其他類型的浮游藍(lán)藻如微囊藻、魚腥藻等共存于富營養(yǎng)化的淺水湖泊中, 并且這兩種浮絲藻種類均能夠產(chǎn)微囊藻毒素[7,25]。Christiansen, et al.在2003年就報(bào)道過阿氏浮絲藻的微囊藻毒素合成基因簇完整序列[13], Rounge, et al.也研究報(bào)道了粉紅浮絲藻的微囊藻毒素合成基因簇[14]。在我國, 浮絲藻廣泛存在于我國不同地域的水體中, 甚至是某些水體的優(yōu)勢種類, 但是至今我國沒有粉紅浮絲藻的相關(guān)報(bào)道[17]。桂佳等報(bào)道過我國某水庫的一株阿氏浮絲藻產(chǎn)微量微囊藻毒素, 但是該文獻(xiàn)沒有對(duì)其微囊藻毒素合成基因進(jìn)行序列測序研究[26]。除此之外, 幾乎沒有其他關(guān)于浮絲藻的微囊藻毒素及毒素合成基因的相關(guān)報(bào)道。因此研究我國浮絲藻的產(chǎn)毒情況及毒素合成基因序列多樣性十分必要, 可以為評(píng)估水體中有害藍(lán)藻的組成及潛在危害提供一定的參考。

微囊藻毒素作為藍(lán)藻的次級(jí)代謝產(chǎn)物, 其合成受到毒素合成酶基因的調(diào)控, 研究表明有些微囊藻毒素合成關(guān)鍵基因的缺失會(huì)導(dǎo)致微囊藻毒素?zé)o法正常合成, 如mcyA, -B, -D, -E和-F基因等, 而有些毒素基因如修飾酶基因 mcyJ的缺失僅能影響到藻株無法合成特異的甲基化的微囊藻毒素異構(gòu)體[13]。因此可以通過特異性引物PCR檢測微囊藻毒素合成的關(guān)鍵基因來檢測藍(lán)藻的產(chǎn)毒情況。該方法可用來檢測純?cè)逯甑漠a(chǎn)毒特性, 也可應(yīng)用于監(jiān)測環(huán)境水樣毒素基因的拷貝數(shù)從而評(píng)估水華暴發(fā)期有害藍(lán)藻的危害性。本文對(duì)分離自我國不同省份水體中的13株浮絲藻進(jìn)行了16S rRNA基因序列分析及微囊藻毒素合成酶基因的檢測, 分別選取毒素合成的關(guān)鍵酶基因序列 mcyA、mcyE及浮絲藻所特有的硫酯酶基因mcyT序列進(jìn)行PCR檢測。根據(jù)16S rRNA基因序列擴(kuò)增及測序結(jié)果, 可以鑒定這13株藻株均為阿氏浮絲藻種類。微囊藻毒素合成酶基因檢測研究結(jié)果表明這13株阿氏浮絲藻缺失mcyA及mcyE基因序列,均能檢測到mcyT基因序列。mcyT是浮絲藻微囊藻毒素合成基因簇中所特有的編碼硫酯酶的基因, 該基因在微囊藻、魚腥藻等的微囊藻毒素合成基因簇中并不存在[5], 并且已有文獻(xiàn)報(bào)道該基因在不產(chǎn)毒浮絲藻的基因組中也可能存在[18]。由于這13株浮絲藻僅能檢測到mcyT基因, 說明這13株浮絲藻沒有完整的微囊藻毒素合成酶基因簇, 屬于毒素合成基因缺陷型藻株, 不具備產(chǎn)微囊藻毒素的能力。根據(jù)分子系統(tǒng)分析, 發(fā)現(xiàn)這13株藻的mcyT基因序列與GenBank中的無毒浮絲藻序列在NJ樹中聚為一簇,與產(chǎn)毒浮絲藻相區(qū)分, 這與我們所檢測的結(jié)果相一致。而這13株藻的16S rRNA序列在分子系統(tǒng)樹中與產(chǎn)毒浮絲藻是聚在一簇的, 可以說明浮絲藻的mcyT基因序列在一定范圍內(nèi)能夠?qū)a(chǎn)毒浮絲藻與不產(chǎn)毒浮絲藻通過分子系統(tǒng)關(guān)系區(qū)分開來。關(guān)于產(chǎn)毒浮絲藻與不產(chǎn)毒浮絲藻的微囊藻毒素合成基因的序列差異性相關(guān)報(bào)道很多, Christiansen, et al.研究發(fā)現(xiàn) 25株無毒型浮絲藻的微囊藻毒素合成基因簇缺陷型存在 4種類型, 其中 3種缺陷型含有完整的mcyT基因序列, 而只有1株浮絲藻沒有mcyT基因而獨(dú)立成為一種缺陷類型[18], 這說明 mcyT序列在不產(chǎn)毒浮絲藻中是廣泛存在的, 該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

隨著浮絲藻在我國藍(lán)藻水華現(xiàn)象中越來越普遍,研究不同水體中的浮絲藻組成、產(chǎn)毒特性及毒素基因序列多樣性是十分必要的。本研究中的13株阿氏浮絲藻分離自我國中東西北部部分省份, 均沒有檢測到毒素合成酶基因。但是由于本研究所用藻株數(shù)量偏少, 并不能代表我國大部分水體中的浮絲藻均是毒素合成基因缺陷型。因此仍然需要大量檢測分離于我國不同水環(huán)境的浮絲藻的產(chǎn)毒特性, 以期更全面更有效地評(píng)估我國不同類型的有害藍(lán)藻水華的危害性。而在本研究中13株浮絲藻mcyT基因之間的序列相似度很高, 并且可以與國外產(chǎn)毒浮絲藻序列相區(qū)別開來, 該結(jié)果可以為后續(xù)研究我國浮絲藻的毒素相關(guān)基因的多樣性以及它們的分子監(jiān)測提供參考。