李 艷，陳 駿，黎開燕，李文勝

(1．湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院，湖北 宜昌443100;2．湖北省宜昌市夷陵區(qū)醫(yī)療保險局，湖北 宜昌443100)

冷飯團為木蘭科植物冷飯團Kadsura coccinea(Lem．)A．C．Smith的根及藤莖，產(chǎn)于湖北、四川等地，又名緋紅南五味子、黑老虎等。其性味苦、溫，有行氣活血、消脹止痛之功效，民間常用于治療風濕骨痛、跌打扭傷、婦女痛經(jīng)、慢性胃炎等癥［1］。冷飯團具有抗肝纖維化、抗氧化、抗血小板、抗HIV病毒、抗衰老等多種藥理作用［2－3］，但對其抗炎作用的藥理研究卻少見報道。本研究對冷飯團的抗炎作用及其可能機制進行了實驗分析，旨在為進一步開發(fā)利用冷飯團藥用資源提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，雄性;昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄兼用。均由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證號:SCXK2010－0007)。

1.1.2 試藥 冷飯團藤莖采自夷陵區(qū)，切薄片，干燥，水煎2次，每次60 min，濾過，合并濾液，置水浴上濃縮至1 mL含生藥0．15 g、0．3 g和0．6 g 3種濃度的水煎液。地塞米松磷酸鈉注射液，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號:120516)。雷公藤多苷片，浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)(批號:20110924)，臨用時用注射用水配制成0．5 g/L濃度的混懸液。弗氏完全佐劑(FCA)，美國Sigma公司產(chǎn)品。白細胞介素－1β(IL－1β)、腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)和前列腺素E2(PGE2)試劑盒均由北京華英生物技術研究所提供，一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn))，YLS－7A型足趾容積測量儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))，SN－682型放射免疫γ計數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn))，JA2003A型電子精密天平(上海精天電子儀器有限公司生產(chǎn))，DL－8R型冷凍離心機(上海離心機械研究所生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 取健康小鼠50只，隨機分為5組，即模型對照組、地塞米松組和冷飯團低、中、高劑量組，每組10只。各組小鼠均按10 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃給藥，其中模型對照組灌服生理鹽水，地塞米松組灌服0．5 g/L濃度的地塞米松磷酸鈉溶液，冷飯團低、中、高劑量組分別灌服低、中、高濃度(1 mL 含生藥 0．15 g、0．3 g 和 0．6 g)的冷飯團水煎液。每天給藥1次，連續(xù)7 d。于末次給藥后30 min，在每只小鼠的左耳前后兩面均勻涂抹二甲苯0．1mL，右耳不做任何處理。60 min后將各組小鼠斷頭處死，沿耳廓基線剪下左右雙耳，用直徑9 mm的打孔器分別在左右兩耳同一部位打下一圓耳片，用扭力天平稱取耳片質(zhì)量，以兩耳片質(zhì)量的差值為腫脹程度。

1.2.2 醋酸致小鼠毛細血管通透性增高實驗 取健康小鼠50只，按1．2．1項下的方法分組和給藥。于末次給藥后60 min，每只小鼠均尾靜脈注射0．5%伊文思藍(Evans Blue)溶液10 mL/kg，隨即腹腔注射0．6%醋酸溶液10 mL/kg。20 min后脫頸椎處死小鼠，每鼠腹腔注射生理鹽水5 mL，并輕揉腹部0．5 min。5 min后剪開小鼠腹部皮膚肌肉，吸取腹腔洗滌液3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液于590 nm波長處測定吸光度值［4］。

1.2.3 大鼠棉球肉芽腫實驗 取健康SD大鼠50只，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，在無菌條件下，切開腹部皮膚，將已稱質(zhì)量的滅菌棉球分別植入大鼠兩側(cè)腹股溝皮下。術后每只大鼠肌肉注射2萬IU青霉素，每天1次，共3次。將大鼠按1．2.1項下的方法分組和給藥，每天1次，連續(xù)7 d。于末次給藥后24 h處死大鼠，將植入的棉球連同周圍結締組織一起取出，除去脂肪組織。置60℃烤箱中烘烤至恒重，電子精密天平稱取質(zhì)量。將稱得的質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫質(zhì)量(以mg/100 g體質(zhì)量表示)。

1.2.4 大鼠佐劑性關節(jié)炎(AA)實驗 取SD大鼠60只，隨機分為正常對照組、模型對照組、雷公藤多苷組和冷飯團低、中、高劑量組，每組10只。各組大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)7 d后，均按10 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)27 d。其中雷公藤多苷組灌服0．5 g/L濃度的雷公藤多苷混懸液，冷飯團低、中、高劑量組分別灌服低、中、高濃度(1 mL含生藥0．15 g、0．3 g 和 0．6 g)的冷飯團水煎液，正常對照組和模型對照組灌服等體積的生理鹽水。除正常對照組外，其余各組大鼠于第3天給藥后，在每只大鼠雙后足的踝關節(jié)處做一標記線，用足趾容積測量儀測量每只大鼠左、右后足標記線以下的容積。將動物用乙醚淺麻醉，在每只大鼠的右后足趾部位皮內(nèi)注射0．05 mL弗氏完全佐劑致炎。于致炎后第24小時和第4天，用致炎前相同的方法測量每只大鼠右后足標記線以下的容積，并于致炎后第16天和第24天同法測量每只大鼠左后足標記線以下的容積，計算各組大鼠左、右后足的腫脹率［5］。于末次給藥后，各組大鼠禁食24 h，在乙醚淺麻醉下經(jīng)腹主靜脈采血，3 500 r/min離心10 min，取血清，－70℃下保存。將大鼠處死，從左后足踝關節(jié)上方0．5 cm處摘取腫脹足爪，縱向切開，放入5 mL冰冷的生理鹽水中，置冷藏箱中浸泡過夜，將浸出液用冷凍離心機離心(3 500 r/min)10 min，取上清液，－70℃下保存。按照試劑盒說明書要求的步驟操作，采用放射免疫法測定血清IL－1β、TNF－α和關節(jié)浸液中PGE2的含量，以硝酸還原酶法測定關節(jié)浸液中NO含量，均由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院測定。

2 結 果

2.1 各組動物耳廓腫脹程度、毛細血管通透性及板球肉芽腫程度比較 小鼠耳廓腫脹程度、毛細血管通透性增高及各組大鼠肉芽腫質(zhì)量，地塞米松組和冷飯團低、中、高劑量組均明顯低于模型對照組(P＜0．05或0．01)。見表1。

表1 各組動物耳廓腫脹、毛細血管通透性和大鼠棉球肉芽腫情況比較(±s)

表1 各組動物耳廓腫脹、毛細血管通透性和大鼠棉球肉芽腫情況比較(±s)

注:①與模型對照組比較，P ＜0．05;②與模型對照組比較，P ＜0．01。

組別 n 耳廓腫脹程度/mg 腹腔伊文思藍吸光度值 肉芽腫質(zhì)量/(mg/100)模型對照組10 28．73±6．26 1．36±0．23 16．07±3．21地塞米松組 10 13．59±3．36② 0．54±0．08② 8．79±2．19②冷飯團低劑量組 10 21．64±5．83① 0．83±0．12② 12．26±2．67①冷飯團中劑量組 10 19．10±4．57② 0．67±0．11② 11．92±2．46①冷飯團高劑量組 10 17．86±4．28② 0．62±0．14② 10．65±2．53②

2.2 各組AA大鼠足腫脹程度比較 大鼠經(jīng)FCA致炎后，右后足出現(xiàn)關節(jié)炎癥狀，腫脹持續(xù)4 d后逐漸減輕。從致炎后第10天開始，大鼠左后足和前肢出現(xiàn)繼發(fā)病變，腫脹持續(xù)至實驗結束。致炎后第24小時和第4天大鼠右后足腫脹率比較，雷公藤多苷組和冷飯團低、中、高劑量組均明顯低于模型對照組(P＜0．05或P＜0．01)。致炎后第16天和第24天大鼠左后足腫脹率比較，雷公藤多苷組和冷飯團中、高劑量組明顯低于模型對照組(P＜0．05或P＜0．01)。見表2。

表2 各組AA大鼠后足腫脹率比較(±s，%)

表2 各組AA大鼠后足腫脹率比較(±s，%)

注:①與模型對照組比較，P ＜0．05;②與模型對照組比較，P ＜0．01。

組別 n右后足腫脹率致炎后24h 致炎后4d左后足腫脹率致炎后24h 致炎后4d模型對照組 10 56．93±12．37 51．54±10．87 49．37±11．06 47．16±9．89雷公藤多苷組 10 31．26±8．74② 29．75±8．13② 28．56±7．73② 27．59±5．46②冷飯團低劑量組 10 44．52±10．86① 40．31±9．67② 39．84±9．80 38．47±10．35冷飯團中劑量組 10 42．43±10．18② 39．51±8．97② 37．78±8．65① 36．49±8．16①冷飯團高劑量組 10 41．27±9．84② 36．87±8．28② 36．10±9．03① 35．85±8．59①

2.3 各組 AA大鼠血清 IL－1β、TNF－α和關節(jié)浸液中PGE2、NO含量比較 大鼠血清IL－1β和關節(jié)浸液中NO含量模型對照組明顯高于正常對照組(P均＜0．01)，雷公藤多苷組和冷飯團中、高劑量組明顯低于模型對照組(P＜0．05或P＜0．01)。各組大鼠血清TNF－α和關節(jié)浸液中PGE2水平模型對照組明顯高于正常對照組(P均＜0．01)，雷公藤多苷組和冷飯團低、中、高劑量組明顯低于模型對照組(P＜0．05或 P ＜0．01)。見表3。

表3 各組AA大鼠血清IL－1β、TNF－α和關節(jié)浸液中PGE2、NO含量比較(±s，n=10)

表3 各組AA大鼠血清IL－1β、TNF－α和關節(jié)浸液中PGE2、NO含量比較(±s，n=10)

注:①與模型對照組比較，P ＜0．05;②與模型對照組比較，P ＜0．01。

組別 IL－1β/(μg/L)TNF－α/(μg/L) PGE2/(μg/L) NO/(μmol/L)正常對照組 67．59±13．03② 21．43±5．89② 9．07±2．69② 20．94±5．67②模型對照組 140．23 ±29．84 58．17±13．72 26．59±7．25 46．70 ±11．21雷公藤多苷組 89．48±19．15② 33．76 ±9．34② 12．45±3．10② 28．36±7．52②冷飯團低劑量組 119．41 ±22．59 44．59 ±10．40① 18．76±5．51① 36．83 ±9．76冷飯團中劑量組 110．27±20．74① 40．85 ±9．56② 17．87±6．06① 34．57±9．09①冷飯團高劑量組 107．78±22．06① 39．22 ±9．87② 16．40±5．62② 33．72±8．78①

3 討 論

炎癥是機體活組織對各種損傷刺激所發(fā)生的以防御為主的反應，急性炎癥表現(xiàn)為炎癥部位紅腫、毛細血管通透性增高而引起炎癥滲出和組織腫脹等，在慢性炎癥期則表現(xiàn)為巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤，引起成纖維細胞增生形成肉芽組織［6］。本研究結果表明，冷飯團能明顯抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹、醋酸所致的小鼠毛細血管通透性增高及棉球誘導的大鼠肉芽腫，說明冷飯團對急性炎癥期的水腫和滲出及炎癥晚期的組織增生和肉芽組織形成均有抑制作用。

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種全身性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性、進行性、對稱性及侵蝕性的外周關節(jié)破壞，可導致關節(jié)功能障礙，有較高的致殘率［7］。在RA的發(fā)病過程中，Th細胞及其所分泌的細胞因子起著重要作用，細胞因子網(wǎng)絡平衡失調(diào)可能是介導RA滑膜慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程的主要因素［8］。RA病變中顯著增高的炎性細胞因子主要是IL－1β和TNF－α，它們在整個病程中始終保持在較高水平，直接介導了關節(jié)的損傷和全身的炎癥反應［9］。IL－1β和TNF－α還可相互誘生，刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞合成PGE2和膠原酶等炎性遞質(zhì)。PGE2能選擇性抑制抑制性T細胞的功能，導致細胞功能亢進，分泌過多的抗體，引起組織器官損傷。局部高濃度的PGE2可導致軟骨基質(zhì)降解、軟骨吸收和骨破壞，還可以共同作用于滑膜巨噬細胞，使其進一步分化為破骨細胞，導致關節(jié)局部滑膜炎癥和軟骨組織破壞［10－11］。NO可促進巨噬細胞合成釋放 IL－1β、TNF－α 等細胞因子，導致滑膜及炎性細胞產(chǎn)生和釋放的前列腺素增多，加重炎癥反應。大鼠AA是一種發(fā)病機制和病理表現(xiàn)特征與人RA相接近的免疫性關節(jié)炎模型，是一種篩選和研究治療RA藥物常用的模型之一［12］。本實驗采用FCA誘導AA模型，大鼠在致炎后24 h右后足腫脹達高峰，原發(fā)病變持續(xù)4 d后逐漸減輕。從致炎后第10天開始，大鼠因遲發(fā)型超敏反應而出現(xiàn)對側(cè)左后足和前肢的腫脹、耳和尾部的關節(jié)炎小結等繼發(fā)病變。而冷飯團不同劑量組大鼠的早期炎癥和繼發(fā)病變均有明顯減輕，血清 IL－1β、TNF－α水平和關節(jié)浸液中PGE2、NO含量亦明顯降低。提示冷飯團抗炎作用的機制可能與其抑制細胞因子IL－1β、TNF－α活性和降低炎癥遞質(zhì)PGE2、NO含量有關。

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