陳 磊，鄭樹艷，黃永望

(1天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211;2天津市咸水沽醫(yī)院)

鼻咽癌是我國南方的常見癌癥之一，抗腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生是其臨床治療失敗的重要原因［1］，主要與耐藥基因?qū)е录毎幬镄罘e降低和腫瘤細胞抗凋亡能力提高有關［2～4］。多重耐藥基因 1(MDR1)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)和B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)的表達增高，以及磷酸化Akt蛋白(p-Akt)過度活化都可以導致耐藥性增加。氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是一種Ⅱ型核受體，被認為是一種抑癌基因，可促進細胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［5］。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物，也是細胞PPAR-γ激動劑。2013年4月～2014年2月，我們利用羅格列酮激活人鼻咽癌CNE1/DDP細胞的PPAR-γ活性，觀察PPAR-γ對細胞順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞系CNE1購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，人鼻咽癌順鉑耐藥細胞系CNE1/DDP為本實驗室通過大劑量沖擊法構(gòu)建。羅格列酮購自浙江萬馬公司，順鉑購自Sigma公司，MTS試劑盒和RT-PCR試劑盒購自Promega公司，凋亡檢測試劑盒購自BD公司，Western抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理 CNE1/DDP細胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，含0.25%胰酶-EDTA消化。取對數(shù)生長期的CNE1/DDP細胞，接種后培養(yǎng)過夜。將細胞隨機分為觀察組和對照組，觀察組分別加入10、20 μg/mL羅格列酮，對照組加入等體積培養(yǎng)液。

1.2.2 細胞耐藥性逆轉(zhuǎn)率檢測 采用MTS法。兩組作用72 h 后，均分別加入 0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L順鉑，培養(yǎng)72 h;吸去培養(yǎng)基，加入MTS培養(yǎng)4 h后，酶標儀檢測490 nm波長下的每孔吸光度(OD值)。細胞抑制率 =(1-OD觀察組/OD對照組)×100%，根據(jù)不同濃度順鉑作用后的細胞抑制率計算IC50，細胞耐藥逆轉(zhuǎn)率 =觀察組 IC50/對照組 IC50×100%。

1.2.3 細胞凋亡和P-gp表達檢測 采用流式細胞術。兩組作用24 h后，均加入20 μmol/L順鉑，培養(yǎng)24 h。Anexin V/PI染色后避光孵育15 min，以流式細胞儀檢測細胞凋亡，F(xiàn)ACSDiva軟件計算細胞凋亡率。兩組以上述方法加入順鉑并培養(yǎng)后，加入PE-P-gp抗體，避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞P-gp表達，P-gp陽性表達為細胞膜與PE-P-gp抗體相結(jié)合，通過488 nm激發(fā)后呈紅色;FACSDiva流式軟件計算P-gp陽性率。

1.2.4 細胞 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 和 p-Akt蛋白表達檢測 采用Western blot法。兩組作用24 h，收集細胞，裂解并提取總蛋白。以12%SDSPAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;分別加入PPAR-γ一抗，以β-actin作為內(nèi)參;4℃孵育過夜，洗去一抗，以HRP連接的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，洗滌后顯示免疫反應條帶。以目的蛋白與β-actin條帶的比值表示其相對表達量。以同樣的方法檢測MDR1、MRP、bcl-2和p-Akt蛋白表達。

1.2.5 細胞 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR法。兩組作用24 h后，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PPAR-γ上游引物:5'-ACTGTCGGTTTCAGAAGTGC-3'，下游引物:5'-ATGGACACCATACTTGAGC-3';MDR1上游引物:5'-TGACATTTATTCAAAGTTAAAAGC-3'，下游引物:5'-TAGACACTTTATGCAAACATTTCAA-3';MRP上游引物:5'-GGGGGAGAAAAGGTCGGCATCG-3'，下游引物:5'-GTGCAGGCCGATCTTGGCGA-3';bcl-2上游引物:5'-ACGGGGTGAACTGGGGGAGGA-3'，下游引物:5'-TGTTTGGGGCAGGCATGTTGACTT-3'。以GADPH為內(nèi)參，上游引物:5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，下游引物:5'-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3'。反應條件:95 ℃、10 s，65 ℃、30 s，72℃、60 s，40個循環(huán)后72℃延伸5 min。目的基因相對表達以 2-ΔΔCT表示。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞耐藥逆轉(zhuǎn)率、細胞凋亡率及P-gp陽性率比較 見表1。

表1 兩組細胞耐藥逆轉(zhuǎn)率、細胞凋亡率及 P-gp陽性率比較(%，±s)

表1 兩組細胞耐藥逆轉(zhuǎn)率、細胞凋亡率及 P-gp陽性率比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 細胞耐藥逆轉(zhuǎn)率 細胞凋亡率 P-gp陽性率100.0 2.2 ±0.3 100.0觀察組10 μg/mL 149.3 ±11.3* 28.7 ±2.1* 62.5 ±4.2*20 μg/mL 293.8 ±25.5＊△ 43.5 ±3.7＊△ 27.5 ±1.6＊△對照組

2.2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 和 p-Akt蛋白相對表達量比較 見表2。

2.3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA 相對表達量比較 見表3。

3 討論

鉑類藥物雖然對鼻咽癌有一定治療效果，但易產(chǎn)生耐藥性而導致治療失敗。腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的常見機制有兩種:①MDR1、MRP1等耐藥基因過表達，這些基因編碼的蛋白可跨膜轉(zhuǎn)運將藥物泵出細胞，降低細胞內(nèi)藥物蓄積;②抗凋亡基因過表達導致細胞抗凋亡，細胞凋亡減少。PPAR-γ屬于PPARs家族的一員，在腫瘤組織中低表達。研究發(fā)現(xiàn)，誘導PPAR-γ活化可阻滯腫瘤細胞生長并誘導其凋亡，但是PPAR-γ在腫瘤耐藥中的作用研究較少。本研究中，我們將CNE1/DDP細胞經(jīng)PPAR-γ激動劑羅格列酮處理24 h后，細胞中PPAR-γ mRNA和蛋白表達提高，CNE1/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著增強。

表2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2和 p-Akt蛋白相對表達量比較(±s)

表2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2和 p-Akt蛋白相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 PPAR-γMDR1 MRP bcl-2 p-Akt觀察組10 μg/mL 1.72 ±0.11* 0.71 ±0.05* 0.66 ±0.03* 0.52 ±0.03* 0.63 ±0.04*20 μg/mL 2.43 ±0.18＊△ 0.27 ±0.02＊△ 0.35 ±0.02＊△ 0.24 ±0.01＊△ 0.34 ±0.02＊△對照組1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

表3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA相對表達量比較(±s)

表3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 PPAR-γmRNA MDR1 mRNAMRP mRNAbcl-2 mRNA 100.0 100.0 100.0 100.0觀察組10 μg/mL 182.3 ±16.5* 64.7 ±5.3* 71.7 ±5.4* 52.8 ±4.1*20 μg/mL 232.4 ±21.7＊△ 12.2 ±0.9＊△ 38.5 ±2.1＊△ 17.6 ±1.1＊△對照組

MDR1基因及其產(chǎn)物P-gp嵌于細胞膜表面形成具有外排功能的能量依賴性“藥泵”，具有逆向轉(zhuǎn)運脂質(zhì)等功能，將細胞內(nèi)帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，防止內(nèi)源性或外源性脂溶性有毒物質(zhì)在胞內(nèi)積聚對細胞造成毒性損害，保持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;但其表達增高使細胞內(nèi)化療藥物達不到有效作用濃度，是腫瘤耐藥的原因之一。MRP可與谷胱甘肽結(jié)合將陰離子的共軛物排泄出細胞，在清除外源性毒素中發(fā)揮作用。在人體正常組織中普遍呈低水平表達，在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織中，也被認為與腫瘤耐藥密切相關。本研究結(jié)果表明，羅格列酮作用后細胞MDR1、MRP mRNA和蛋白表達降低，說明PPAR-γ逆轉(zhuǎn)CNE1/DDP耐藥性的機制可能與其抑制耐藥基因MDR1、MRP的表達有關。Akt在多種腫瘤組織中都有過度表達和活化的現(xiàn)象，化療藥物可增加Akt磷酸化水平，在腫瘤耐藥中主要發(fā)揮促進細胞增殖和抗細胞凋亡作用，使腫瘤細胞產(chǎn)生化療耐受［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ表達增加可使細胞中p-Akt水平降低，說明抑制Akt磷酸化也是PPAR-γ逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞順鉑耐藥性的機制之一。

bcl-2基因是重要的抗凋亡調(diào)控基因，其表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關鍵環(huán)節(jié)。bcl-2基因表達增加，抗凋亡作用增強，細胞凋亡受到抑制，從而導致耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的多藥耐藥與bcl-2基因表達密切相關，可能與其抑制腫瘤細胞凋亡有關［6～12］。同時bcl-2 mRNA和蛋白表達降低并促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性。本研究中，PPAR-γ表達增加使bcl-2 mRNA和蛋白表達降低，同時流式細胞術顯示，腫瘤細胞凋亡率明顯增加。

PPAR-γ對CNE1/DDP細胞的順鉑耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用，且呈劑量依賴性;可能與其抑制Akt磷酸化和耐藥基因MDR1、MRP表達，并促進細胞凋亡有關。

［1］Zuo Q，Shi M，Li L，et al.Development of cetuximab-resistant human nasopharyngeal carcinoma cell lines and mechanisms of drug resistance［J］.Biomed Pharmacother，2010，64(8):550-558.

［2］Zhang KG，Qin CY，Wang HQ，et al.The effect of TRAIL on the expression of multidrug resistant genes MDR1，LRP and GST-π in drug-resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR［J］.Hepatogastroenterology，2012，59(120):2672-2676.

［3］律潔，田玉峰.抑制Src酪氨酸激酶活性對人肺癌A549/DDP細胞耐藥性及MDR1和LRP表達的影響［J］.中國肺癌雜志，2012，15(9):501-506.

［4］江青山，鄧文蓉，肖桃源，等.SAA在鼻咽癌 CNE-2細胞中的表達及其對細胞生長、凋亡的影響［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(45):1-4.

［5］Reka AK，Goswami MT，Krishnapuram R，et al.Molecular cross-regulation between PPAR-γ and other signaling pathways:Implications for lung cancer therapy［J］.Lung Cancer，2011，72(2):154-159.

［6］Zhu Y，Liu XJ，Yang P，et al.Alkylglyceronephosphate synthase(AGPS)alters lipid signaling pathways and supports chemotherapy resistance of glioma and hepatic carcinoma cell lines［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(7):3219-3126.

［7］Chen J，Ding Z，Peng Y，et al.HIF-1α inhibition reverses multidrug resistance in colon cancer cells via downregulation of MDR1/P-glycoprotein［J］.PLoS One，2014，9(6):e98882.

［8］Sezgin Alikanoglu A，Yildirim M，Suren D，et al.Expression of cyclooxygenase-2 and Bcl-2 in breast cancer and their relationship with triple-negative disease［J］.J BUON，2014，19(2):430-434.

［9］Qiang F，Guangguo R，Yongtao H，et al.Multidrug resistance in primary tumors and metastases in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］.Pathol Oncol Res，2013，19(4):641-648.

［10］Shityakov S，F(xiàn)?rster C.Multidrug resistance protein P-gp interaction with nanoparticles(fullerenes and carbon nanotube)to assess their drug delivery potential:a theoretical molecular docking study［J］.Int J Comput Biol Drug Des，2013，6(4):343-357.

［11］Guo Q，Nan XX，Yang JR，et al.Triptolide inhibits the multidrug resistance in prostate cancer cells via the downregulation of MDR1 expression［J］.Neoplasma，2013，60(6):598-604.

［12］Munic'V，Kelneric'Z，Mikac L，et al.Differences in assessment of macrolide interaction with human MDR1(ABCB1，P-gp)using rhodamine-123 efflux，ATPase activity and cellular accumulation assays［J］.Eur J Pharm Sci，2010，41(1):86-95.

［13］Yang M，Huang J，Pan HZ，et al.Triptolide overcomes dexamethasone resistance and enhanced PS-341-induced apoptosis via PI3k/Akt/NF-kappaB pathways in human multiple myeloma cells［J］.Int J Mol Med，2008，22(4):489-496.