范印文，燕建鋒，賀宙斌，吳敬敬，孫 帥，張 璇，帕提曼，楊立潔

(1伊犁哈薩克自治州新華醫(yī)院，新疆伊犁835000;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

地高辛是治療充血性心力衰竭(簡(jiǎn)稱(chēng)心衰)的常用藥，雖效果良好，但其血藥濃度不規(guī)律，且易受多種因素的影響［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，大約有15%的住院患者在服用地高辛之后出現(xiàn)中毒癥狀［2，3］。遺傳因素即編碼P-糖蛋白(P-gp)的基因突變可能使地高辛產(chǎn)生活性差異，其中以多藥耐藥基因1(MDR1)C3435T基因突變具有重要意義，最終會(huì)影響其代謝、吸收和分布。細(xì)胞色素P450(CYP)是一類(lèi)藥物代謝酶，個(gè)體間CYP3A的活性差異被認(rèn)為是藥物利用度和清除率不同的主要原因，而地高辛也已被證實(shí)受CYP3A催化代謝。研究顯示，在控制了各種非遺傳因素后，仍有20%～95%藥物代謝的個(gè)體差異可能由遺傳因素引起［4］。2011年10月～2013年10月，我們檢測(cè)了維吾爾族、漢族心衰患者的MDR1 C3435T和CYP3A4*18B基因多態(tài)性，分析其對(duì)地高辛血藥濃度的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇資料完整的心衰患者80例，均符合以下標(biāo)準(zhǔn):①漢族及維吾爾族患者間無(wú)血緣關(guān)系;②口服地高辛0.125 mg/(次·d)至少1周;③年齡＞18歲;④接受地高辛治療期間聯(lián)合服用的藥物基本一致。排除竇房傳導(dǎo)阻滯、病態(tài)竇房結(jié)綜合征、Ⅱ度及以上房室傳導(dǎo)阻滯、心臟瓣膜病、限制型或肥厚型心肌病、明顯肝腎功能損害、低鉀血癥、心肌梗死急性期伴有進(jìn)行性心肌缺血者。其中維吾爾族40例，男27例、女13例，年齡(64.5±10.1)歲，體質(zhì)量(64.8 ±11.2)kg，NYHA Ⅱ級(jí)11 例、Ⅲ級(jí)20例、Ⅳ級(jí)9例;漢族40例，男22例、女18例，年齡(62.3 ±9.8)歲，體質(zhì)量(63.6 ±10.5)kg，NYHA Ⅱ級(jí)10例、Ⅲ級(jí)23例、Ⅳ級(jí)7例。兩民族年齡、性別及一般資料比較均具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 MDR1 C3435T、CYP3A4*18B 基因型檢測(cè)采用PCR-RFLP法。清晨抽取患者空腹靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝，置于-70℃冰箱保存，采用非離心柱式DNA抽提法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。MDR1、CYP3A4基因序列均來(lái)自Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)，其上下游引物設(shè)計(jì)采用Primier5和Oligo軟件，由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表1。DNA 反應(yīng)體系:10×Buffer 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各 1 μL，ddH2O 21 μL，DNA 2 μL，共50 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火 30 s，75 ℃ 延伸1 min，循環(huán) 30 次;75℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外線下觀察并攝片。將PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物與DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物比較，鑒定基因型。

表1 MDR1 C3435T、CYP3A4*18B基因引物序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度及退火溫度

1.2.2 地高辛血藥濃度檢測(cè) 清晨抽取患者空腹靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝，置于-80℃冰箱保存。4 000 r/min離心4～5 min，取上清。采用日立741-0050全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)地高辛血藥濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。參考值為0.9～2.0 ng/mL，＞2.0 ng/mL被認(rèn)為中毒。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)患者基因分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 維吾爾族、漢族心衰患者M(jìn)DR1 C3435T、CYP3A4*18B基因中3個(gè)等位基因的野生型純合子(CC)、突變型雜合子(CT)與突變型純合子(TT)分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P均＞0.05)。各等位基因的基因型分布，見(jiàn)表2。

表2 維吾爾族、漢族MDR1 C3435T、CYP3A4*18B基因型分布［例(%)］

2.2 基因型對(duì)地高辛血藥濃度的影響 維吾爾族患者地高辛血藥濃度為(0.81±0.22)ng/mL，漢族為(1.23 ±0.24)ng/mL，P ＜0.05。兩民族 MDR1 C3435T、CYP3A4*18B不同基因型患者地高辛血藥濃度比較，見(jiàn)表3。

表3 兩民族不同基因型患者地高辛血藥濃度比較(ng/mL，±s)

表3 兩民族不同基因型患者地高辛血藥濃度比較(ng/mL，±s)

注:與維吾爾族同基因型比較，*P＜0.05;與同民族CC基因型比較，#P＜0.05

血藥濃度民族 n MDR1 C3435T CYP3A4*18B CC CT TT維吾爾族 40 0.74 ±0.18 0.82 ±0.15 0.79 ±0.22 0.86 ±0.18 0 CC CT TT.78 ±0.19 0.95 ±0.15漢族 40 0.76 ±0.15 1.12 ±0.17*# 1.44 ±0.13*#0.91 ±0.21 0.75 ±0.18 0.87 ±0.20

3 討論

地高辛能有效增加心肌收縮力，但其劑量過(guò)大時(shí)可直接抑制竇房結(jié)、房室結(jié)而呈現(xiàn)竇性心動(dòng)過(guò)緩和不同程度的房室傳導(dǎo)阻滯。MDR1基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，編碼P-gp，其中位于第26號(hào)外顯子的C3435T具有重要的意義。P-gp的主要功能是將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的作用底物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，而MDR1 C3435T基因突變能使P-gp水平降低，進(jìn)而影響藥物的吸收與代謝［5］。研究顯示，MDR1 C3435T的基因多態(tài)性存在較大種族差異。本研究對(duì)維吾爾族、漢族心衰患者M(jìn)DR1 C3435T基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)顯示，維吾爾族 CC、CT、TT基因型頻率分別為72.5%、20.0%、7.5%，漢族分別為 65.0%、22.5%、7.5%，分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。與岑宇翔等［6］報(bào)道的漢族MDR1 C3435T基因型頻率有差異，考慮可能是研究對(duì)象數(shù)量較少以及地域差異等因素造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，漢族MDR1 C3435T基因CT、TT型患者地高辛血藥濃度均高于CC型和維吾爾族同基因型患者(P均＜0.05)，而維吾爾族MDR1 C3435T各基因型患者地高辛血藥濃度比較無(wú)明顯差異(P均＞0.05)。本研究中MDR1 C3435T基因型對(duì)漢族患者血藥濃度的影響結(jié)果與Hoffmeyer、Johne等［7，8］的研究報(bào)道一致，同時(shí)他們認(rèn)為 MDRT等位基因的突變使P-gp表達(dá)降低，從而導(dǎo)致TT型患者地高辛血藥濃度高于CC型。

CYP3A4是人類(lèi)肝臟中含量最為豐富的CYP酶，約占成人肝臟酶總量的25%;大約有150多種藥物是它的底物，約占全部藥物的50%。因此，CYP3A4是影響藥物療效和安全性的重要因素之一［9］。CYP3A4*18B是日本人群中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新位點(diǎn)，也是CYP3A4單核苷酸多態(tài)性(SNPs)突變頻率最高的一個(gè)位點(diǎn)［10］，該基因的突變可能提高CYP3A4蛋白活性。本研究顯示，維吾爾族CC、CT、TT 基因型頻率分別為65.0%、26.0%、10.0%，漢族分別為 65.0%、22.5%、7.5%，分布符合 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn);但是維吾爾族和漢族CYP3A4*18B各基因型患者地高辛血藥濃度比較無(wú)顯著差異(P均 ＞0.05)。與郭濤等［11］的研究結(jié)果相似。

綜上所述，MDR1 C3435T基因多態(tài)性可能會(huì)提高漢族心衰患者的地高辛血藥濃度，對(duì)維吾爾族患者則無(wú)影響;而CYP3A4*18B基因多態(tài)性對(duì)兩民族心衰患者的地高辛血藥濃度均沒(méi)有明顯影響。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與基因的表達(dá)調(diào)控受多種因素的影響以及本研究樣本量不夠大有關(guān)，因此下一步實(shí)驗(yàn)還需擴(kuò)大樣本量，并考慮多個(gè)相關(guān)基因間的連鎖作用，嚴(yán)格控制可以影響血藥濃度的各種因素。

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