江 海 李 斌 魏遠福 王 波

食管癌的浸潤轉(zhuǎn)移是影響術(shù)后患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。nm23 是一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因，其主要通過促進細胞的分化、參與免疫防御，從而抑制腫瘤細胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移［1］。E-cadherin 是一種細胞黏附分子，有研究表明E-cadherin 低表達與腫瘤細胞的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［2］。

本研究采用免疫組織化學(xué)S-P 法檢測nm23 和E-cadherin蛋白的表達，探討其與食管鱗癌的發(fā)生、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從而進一步探討E-cadherin 蛋白與nm23 蛋白之間的相關(guān)性，為預(yù)測食管鱗癌的轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料 選取2010 年1 月～20012 年7 月期間在鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)前均未接受過放療、化療及免疫治療的食管癌標(biāo)本68 例，其中女性30 例，男性38例，年齡35～78 歲，中位年齡56.5 歲。低分化鱗癌14 例，中分化鱗癌29 例，高分化鱗癌25 例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌30例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌38 例;有纖維膜浸潤的鱗癌56 例，無纖維膜浸潤的鱗癌12 例。同時取距腫瘤5cm 的正常食管黏膜組織23 例作對照。

1.2 方法 選取的食管鱗癌組織和正常食管黏膜組織行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4μm，分別作HE 染色﹑免疫組化和陰性對照用。采用免疫組化技術(shù)(S-P 法)對各組標(biāo)本中的E-cadherin 和nm23 進行檢測，鼠抗人nm23 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人nm23 單克隆抗體和鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體均采用微波修復(fù)抗原，操作步驟按說明書進行，用PBS 代替一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 nm23 結(jié)果判定:根據(jù)參考文獻［3］nm23 蛋白陽性表現(xiàn)為腫瘤細胞胞漿內(nèi)和/或細胞膜上棕黃色顆?；驁F塊，結(jié)果以陽性細胞數(shù)所占百分比來表示，按照美國Sabina signiretti判斷標(biāo)準(zhǔn)，每張切片由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生觀察10 個具有代表性的高倍視野，每個高倍視野記數(shù)200 個腫瘤細胞，按照鏡下陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分率綜合判斷，以腫瘤細胞中著色細胞的百分率來表示＜10%記為陰性(-)，＞25%記為陽性(+)。

1.3.2 E-cadherin 結(jié)果判定:根據(jù)參考文獻［4］的方法，以細胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。對每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200 個細胞，共計1000 個，計數(shù)陽性細胞并計算其所占比例:陽性細胞＜25%，判定為陰性表達，陽性細胞＞25%，判定為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗及配對χ2相關(guān)分析，t檢驗、方差分析(F 檢驗)，以a=0.05 為檢驗水準(zhǔn)，當(dāng)P ＜0.05 時表明在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性意義，P ＞0.05 為差別無顯著性意義。統(tǒng)計工具應(yīng)用SAS6.12 統(tǒng)計軟件包。

2.結(jié)果

2.1 nm23 免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化檢測結(jié)果顯示(表1):nm23 正常食管組織中和在食管鱗癌陽性表達率分別是93.3%(28/30)及75%(35/68)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。nm23 在高、中及低分化食管鱗癌組織中陽性率分別為52%(13/25)，51.7%(15/29)和50%(7/14)，三組之間差異無顯著性意義(P ＞0.05)。nm23 在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中陽性表達率分別是52.7% (20/38)及36.7%(11/30)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。nm23在食管鱗癌組織中有、無浸潤至纖維膜中的陽性表達率分別是75%(42/56)及41.7%(5/12)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。

表1 nm23 在食管鱗狀細胞癌和正常食管黏膜組織中的表達

2.2 E-cadherin 免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化檢測結(jié)果顯示(見表2):E-cadherin 蛋白在正常的食管鱗狀上皮組織中以基底層細胞和棘層細胞表達最強。E-cadherin 蛋白在食管鱗癌和正常食管組織中陽性表達率分別是69.1%(47/68)及100%(30/30)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在高、中、低分化的癌組織的陽性表達率分別為84%(21/25)，72.4%(21/29)和51.1%(8/14)，結(jié)果顯示Ecadherin 蛋白在食管鱗癌組織的不同分化程度中的表達有明顯差異(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在有、無淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達率分別為57.9%(22/38)和80%(24/30)，二者的陽性表達率差別有顯著意義(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在有、無纖維膜浸潤的食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為71.4%(40/56)和66.7%(8/12)，二者的陽性表達率差別無顯著意義(P ＞0.05)。

2.3 nm23 與E-cadherin 的關(guān)系 食管癌組織中nm-23的表達與E-cadherin 的表達呈正相關(guān)(P ＜0.05，表3)，提示nm-23 與E-cadherin 在促進食管癌的分化，抑制食管癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中，可能有正向調(diào)節(jié)的協(xié)同作用。

表2 E-Cadherin 在食管鱗狀細胞癌和正常食管黏膜組織中的表達

表3 nm23 和E-Cadherin 在食管鱗狀細胞癌中表達的相互關(guān)系

3.討論

1988 年美國國立癌癥研究所的steeg 等，應(yīng)用差異雜交(differential hybridization)等技術(shù)從小鼠黑色素瘤k-1735 細胞株中分離出腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23［5］。目前多研究表明，在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤中nm23 的表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)密切［6，7］。Nm23 可能通過對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白或基因的調(diào)控而抑制細胞的轉(zhuǎn)移［8］。同時也通過改變腫瘤細胞骨成分結(jié)構(gòu)，使細胞形態(tài)發(fā)生變化，從而抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［9］。

本研究研究發(fā)現(xiàn)，nm23 在食管鱗癌組織中的表達低于正常組織，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，提示nm23 的低表達可能與食管癌的發(fā)生有關(guān)。nm23 在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的食管癌組織中的陽性表達率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示nm23 的低表達可能與食管鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。nm23 在無纖維膜浸潤的食管癌組織中的陽性表達率高于有纖維膜浸潤組，提示nm23 的低表達可能與食管鱗狀細胞癌的浸潤有關(guān)。其表明nm23 表達降低，機體對腫瘤細胞的抑制力減低，使其更易向周圍組織浸潤及轉(zhuǎn)移。

E-cadherin 是維持細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性和極性的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白。有研究表明，當(dāng)腫瘤細胞的E-鈣黏附素發(fā)生基因突變、轉(zhuǎn)錄受抑、啟動子區(qū)域GpG 高度甲基化或翻譯紊亂時，其功能發(fā)生障礙，而使腫瘤細胞發(fā)生侵襲性生長，同時是腫瘤細胞分化程度降低及易脫離原發(fā)灶而發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移［10］。本研究表明食管癌中存在明顯的E-cadherin 表達缺失或表達水平的降低(P ＜0.05)，從蛋白水平上證明了E-cadherin 基因的失活與食管癌的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)伴無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織E-cadherin 蛋白的陽性表達率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P ＜0.05)，低分化的癌組織Ecadherin 蛋白的陽性表達率明顯低于高分化的癌組織(P ＜0.05)，這說明E-cadherin 表達的減少與食管鱗癌分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示食管鱗狀細胞癌組織中nm-23 的表達與E-cadherin 的表達呈正相關(guān)(P ＜0.05)，提示E-cadherin 與nm-23 在抑制食管癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中，以及促進食管癌的分化中，可能有正向調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，共同抑制食管鱗癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，兩者表達水平的增高可能共同抑制淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，但這并不能說明nm23 能夠促進E-cadherin 的表達，其具體作用機制目前尚不太清楚，nm-23 與E-cadherin 的關(guān)系還有待于進一步研究。

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3 Steeg PS.Perspectives on classic article:metastasis suppressor genes［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96(6):E4.

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