王鑫，梁文輝，劉穎慧，趙富華，法蕓

（1.青島大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266071；2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，生物基材料重點實驗室，山東青島 266101；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

葡萄糖酸和葡萄糖酸鹽是具有廣泛用途的有機(jī)酸（鹽），它們可直接用作食品、飲料及醫(yī)藥生產(chǎn)中的添加劑，可替代能污染環(huán)境的多磷酸鹽來制造清潔劑，可成為生物降解的螯合劑，還可作為織物加工和金屬加工的助劑，在建筑工業(yè)上作為混凝土的塑化劑、減水劑和緩凝劑，及用于電鍍、膠卷制造等許多工業(yè)領(lǐng)域［1］。然而目前我國葡萄糖酸鹽的年產(chǎn)量不足千噸，因此對葡萄糖氧化制葡萄糖酸（鹽）反應(yīng)的研究具有重要意義。相關(guān)研究需要準(zhǔn)確了解不同反應(yīng)階段或反應(yīng)類型的樣品中葡萄糖和葡萄糖酸含量［2–5］。

高效液相色譜（HPLC）法是目前廣泛應(yīng)用的分析手段［6–8］，其中離子色譜法利用離子排斥分離，但反應(yīng)物葡萄糖與其氧化產(chǎn)物葡萄糖酸鈉的出峰位置重合，需要串聯(lián)紫外檢測器和示差檢測器檢測［9–10］。該方法的靈敏度相對較低，低濃度的組分不易檢測。含有金屬催化劑的反應(yīng)體系，基體對離子色譜柱的影響較大，檢測結(jié)果不夠理想。高效陰離子交換色譜–積分脈沖安培法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種食品和飲料中糖的分析［11–16］，主要利用離子色譜專用糖柱來分離，如Thermo Fisher公司的CarboPac PA20，CarboPac PA10等色譜柱，但該體系用于葡萄糖和葡萄糖酸（鹽）的分離仍存在共淋洗的問題。

筆者采用陰離子柱IonPac AS11–HC，利用積分脈沖安培檢測，實現(xiàn)了葡萄糖與葡萄糖酸的完全基線分離，有效解決了基體干擾和靈敏度低的問題。該方法簡單，分析速度快，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

多功能離子色譜系統(tǒng)：ICS–5000型，雙泵模塊、電化學(xué)檢測器／色譜模塊、淋洗液自動發(fā)生器模塊、自動進(jìn)樣器模塊，Chromeleon 6.8色譜軟件，美國Thermo Scientific公司；

超純水制備儀：Milli-Q?Advantage A10型，美國密理博公司；

葡萄糖與葡萄糖酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：優(yōu)級純，純度不低于99.5%，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

樣品：鎳催化劑，堿性條件下的葡萄糖氧化反應(yīng)液；

實驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 色譜條件

色譜柱：IonPac AS11–HC型陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm），IonPac AG11–HC型保護(hù)柱（50 mm×4 mm）；流動相：5 mmol／L KOH溶液，流量為1.0 mL／min，等度洗脫；進(jìn)樣體積：25μL；柱溫：30℃；脈沖安培檢測；金工作電極；Ag／AgCl 參比電極；檢測電位波形見表1。

表1 檢測電位波形

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制100 mg／L葡萄糖和葡萄糖酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后用其配成表2中不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x (mg／L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度 mg／L

1.4 樣品處理

取3.0 mL樣品，置于5 mL塑料離心管中，以6 000 r／min速度離心5 min，固體雜質(zhì)沉淀于離心管底。取適量上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除去微米級懸浮物，濾液待檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

利用離子排斥原理分離，若采用BioRad Aminex HPX–87H色譜柱，流動相為0.005 mol／L的H2SO4水溶液，葡萄糖與其氧化產(chǎn)物葡萄糖酸鈉，出峰位置重合，需要串聯(lián)紫外檢測器和示差檢測器檢測。利用陰離子交換原理分離，先選擇Thermo Fisher的專用糖柱CarboPac PA20，CarboPac PA10色譜柱對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，葡萄糖和葡萄糖酸（鹽）的分離仍存在共淋洗。因此選擇季銨鹽乳膠直徑小的IonPac AS11–HC色譜柱分離。

一般來說，無機(jī)和有機(jī)酸的pKa值大于7的鹽均可作IC中的離子淋洗液。OH–是最合適的淋洗離子，因為只要抑制器的容量足夠大，OH–在抑制器全部被轉(zhuǎn)化為水而與其初始及最終濃度無關(guān)。OH–淋洗液是堿性溶液，容易吸收空氣中的二氧化碳，因此必須嚴(yán)格控制配制條件［17］。而用淋洗液在線發(fā)生器是一個很好的選擇，可以消除人工配制溶液和試劑雜質(zhì)等引入的誤差，色譜重現(xiàn)性良好。

試驗了多個淋洗液濃度（1.0，2.0，2.5，5.0，7.5，10.0，15.0 mmol／L），流量為1.0 mL／min進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5.0 mmol／L KOH淋洗液可使葡萄糖和葡萄糖酸鈉實現(xiàn)了完全的基線分離，而且分析工作在15 min內(nèi)完成，效率較高。因此選擇KOH淋洗液的濃度為5.0 mmol／L。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照表2數(shù)據(jù)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，以峰面積y為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x(mg／L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（3倍的噪音／響應(yīng)值）見表3。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限

2.3 方法精密度

選擇表2中5#混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定結(jié)果見表4。由表4可知，葡萄糖及葡萄糖酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.50%。

表4 精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.4 加標(biāo)回收試驗

在反應(yīng)時間為2.0 h的樣品中，加入質(zhì)量濃度均為10.0 mg／L的葡萄糖、葡萄糖酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3樣品處理方法處理后測定，測定結(jié)果見表5。由表5可知，葡萄糖、葡萄糖酸鈉的平均回收率分別為99.50%，109.0%，表明本法測量準(zhǔn)確度較高。

表5 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

圖1為加標(biāo)質(zhì)量濃度為1.00 mg／L的樣品色譜圖。由圖1可知，葡萄糖、葡萄糖酸實現(xiàn)了完全的基線分離。

圖1 加標(biāo)樣品中葡萄糖和葡萄糖酸的色譜圖

2.5 實際樣品分析

將4個不同反應(yīng)時間的葡萄糖催化反應(yīng)液樣品按照1.3樣品處理方法進(jìn)行處理，樣品中葡萄糖和葡萄糖酸鈉得到了較好分離，色譜峰形尖銳，測定結(jié)果列入表6。圖2為測定4個實際樣品的離子色譜圖。

3 結(jié)語

采用陰離子交換–脈沖安培檢測法測定葡萄糖催化反應(yīng)液中葡萄糖和葡萄糖酸鈉的含量，該法操作簡單，靈敏度較高，重現(xiàn)性和相關(guān)性好。該方法為葡萄糖氧化制葡萄糖酸（鹽）反應(yīng)的研究提供了有效的技術(shù)手段。

表6 不同反應(yīng)時間樣品的測定結(jié)果 mg／L

圖2 標(biāo)準(zhǔn)混合物和四種樣品的色譜圖。

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