李克方

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052）

高膽紅素血癥大鼠聽(tīng)力損傷與耳蝸核CaM活性的相關(guān)性研究

李克方

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052）

目的 研究高膽紅素血癥大鼠聽(tīng)力損傷的機(jī)制及CaM活性變化在此損傷中的作用。方法 60只新生7 d SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）和實(shí)驗(yàn)組（M組），測(cè)試各組動(dòng)物腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位（ABR），檢測(cè)各組血清膽紅素濃度和腦組織膽紅素含量，測(cè)試各組大鼠耳蝸核CaM的免疫組化平均灰度值。結(jié)果 M組用藥后ABR反應(yīng)閾明顯升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期明顯延長(zhǎng)；M組耳蝸核CaM免疫組化平均灰度值明顯低于C組。結(jié)論 CaM活性升高在高膽紅素血癥聽(tīng)力損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

高膽紅素血癥；CaM；聽(tīng)性腦干反應(yīng)；聽(tīng)力損傷

新生兒高膽紅素血癥常導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，尤其以聽(tīng)力損傷最常見(jiàn)。近年來(lái)研究表明神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是神經(jīng)細(xì)胞損傷重要機(jī)制。而細(xì)胞內(nèi)超載的Ca2+必須與鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）結(jié)合以后形成Ca2+-CaM復(fù)合物，才能使靶酶啟動(dòng)，從而引起一系列病理反應(yīng)［1］，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損害。為了探討高膽紅素血癥時(shí)CaM在聽(tīng)力損傷中的作用，本課題成功制作高膽紅素血癥動(dòng)物模型，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)耳蝸核組織CaM活性變化，研究與聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）的相關(guān)性，探討膽紅素在聽(tīng)覺(jué)中樞損傷中的的作用機(jī)制，為防治膽紅素導(dǎo)致的聽(tīng)力損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組：生后7 d SD大鼠60只，體質(zhì)量9～20 g，雌雄不限，動(dòng)物均無(wú)耳毒性藥物使用及強(qiáng)噪聲暴露史。隨機(jī)分為對(duì)照組（C組），實(shí)驗(yàn)組（M組），每組30 只。

1.2 配制膽紅素溶液： 避光環(huán)境下稱取膽紅素晶體20 mg溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH中，加入雙蒸水9 mL，用0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至8.5，即配置成注射用膽紅素溶液［2］，濃度為3.42 mmol/L。

1.3 制備高膽紅素血癥動(dòng)物模型：向M組大鼠腹腔內(nèi)注射膽紅素溶液，注射劑量為200 μg/g體質(zhì)量，給藥后于恒溫恒濕和避光環(huán)境中自然哺育24 h。C組大鼠以0.5 mL生理鹽水代替膽紅素溶液腹腔內(nèi)注射，其余條件與M組相同［3］。

1.4 聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試：各組動(dòng)物分別測(cè)試ABR反應(yīng)閾，ABR反應(yīng)閾的判定以Ⅱ波為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 血清膽紅素濃度測(cè)定：將各組動(dòng)物斷頭取血0.5 mL，重氮反應(yīng)法測(cè)定血清膽紅素濃度［4］。

1.6 腦組織膽紅素濃度測(cè)定：將各組動(dòng)物取出腦組織后，將腦組織沿正中線切開(kāi)，稱重后置2 mL冰醋酸中勻漿，加同體積丙酮混勻離心（3000 r/min×10 min），抽提上清液0.2 mL加于測(cè)試管中，根據(jù)腦組織膽紅素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出腦組織膽紅素濃度［5］。

1.7 耳蝸核標(biāo)本制作：各組動(dòng)物在進(jìn)行ABR測(cè)試后，開(kāi)顱并取出腦干，經(jīng)石蠟包埋，經(jīng)面神經(jīng)根平面從前向后做連續(xù)冠狀切片［6］，片厚7 μm，取從耳蝸核開(kāi)始出現(xiàn)至消失的切片。耳蝸核的定位參照《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦立體定位圖譜》［7］和《大白鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)基礎(chǔ)》［8］。

1.8 耳蝸核CaM免疫組化染色：免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，經(jīng)DAB顯色，顯微鏡下觀察并控制反應(yīng)時(shí)間，見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。。

1.9 圖像分析：將免疫組化染色結(jié)果輸入HPIAS-1000電子計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)，分析各組大鼠耳蝸核CaM免疫組化染色的平均灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，ABR反應(yīng)閾和血清、腦組織膽紅素含量及CaM免疫組化平均灰度值的各項(xiàng)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清和腦組織膽紅素濃度：M組血清膽紅素濃度（546.635±12.348）μmol/L明顯高于C組（15.046±0.927）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組腦組織膽紅素含量為0，M組腦組織膽紅素含量明顯增高（6.541±0.169）nmol/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 ABR測(cè)試結(jié)果：M組動(dòng)物用藥后ABR反應(yīng)閾明顯升高（59± 7.18）dB SPL，與C組ABR反應(yīng)閾（16±5.98）dB SPL相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 耳蝸核組織CaM免疫組化活性：光鏡下可見(jiàn)耳蝸核內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞為體積比較小的圓形及類圓形細(xì)胞，少數(shù)體積較大細(xì)胞可以見(jiàn)到有明顯突起。耳蝸核中CaM免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物為棕黃色顆粒狀沉積物，主要位于耳蝸核神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中，神經(jīng)纖維內(nèi)也可見(jiàn)到棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)物。陰性對(duì)照切片無(wú)棕黃色顆粒。M組耳蝸核CaM免疫組化平均灰度值（139.20±5.37 ）度明顯低于C組（208.10±7.85 ）度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

新生兒高膽紅素血癥若并發(fā)膽紅素腦病常遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，聽(tīng)力損傷尤為常見(jiàn)。但是目前對(duì)高膽紅素血癥時(shí)聽(tīng)力損傷的發(fā)病機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用出生后1周的SD大鼠腹腔內(nèi)注射膽紅素，制作高膽紅素血癥動(dòng)物模型，隨著血清膽紅素量的增加，耳蝸核組織中膽紅素沉積的量也隨之增加。

聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上的第一級(jí)中樞即為耳蝸核，是全部同側(cè)傳入聽(tīng)神經(jīng)的終結(jié)點(diǎn)，與更高一級(jí)聽(tīng)覺(jué)中樞以及其他相關(guān)聽(tīng)覺(jué)核團(tuán)具有密切聯(lián)系［9］。大鼠耳蝸核組織HE染色切片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠耳蝸核中各亞核神經(jīng)細(xì)胞體積明顯腫脹，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目相對(duì)明顯減少，細(xì)胞核和胞質(zhì)皺縮，脂褐素沉積，胞質(zhì)內(nèi)形成較多空泡，尼氏體相應(yīng)減少。這表明膽紅素沉積于耳蝸核，改變了耳蝸核的正常組織結(jié)構(gòu)。

膽紅素沉積于耳蝸核的神經(jīng)細(xì)胞突觸膜，進(jìn)一步導(dǎo)致耳蝸核的超微結(jié)構(gòu)線粒體腫脹，造成能量代謝障礙；Ca2+內(nèi)流并在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)量超載，與CaM結(jié)合后形成Ca2+-CaM復(fù)合物，發(fā)揮毒性作用，導(dǎo)致耳蝸核神經(jīng)細(xì)胞損傷，使耳蝸核信息的傳入功能受到影響，并且可造成耳蝸核對(duì)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)分析和加工功能減弱，向其他核團(tuán)傳入的信息數(shù)量減少或質(zhì)量異常，使神經(jīng)細(xì)胞對(duì)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)反應(yīng)性降低，聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，故ABRⅠ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期明顯延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著腦組織膽紅素含量的增加，耳蝸核CaM的免疫組化平均灰度值明顯下降，耳蝸核CaM的活性增加，ABR閾值升高，各波的潛伏期延長(zhǎng)，提示CaM活性升高在高膽紅素血癥所造成聽(tīng)力損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

［1］ Yabe D，Nakamura T，Kanazawa N，et al.Calumenin， a Ca2+-binding protein retained in the endoplasmic reticulum with a novel carboxyl-terminal sequence，HDEF［J］.J Biol Chem，1997，272（29）:18232-18239.

［2］ Rhee CK，Park HM，Jang YJ.Audiologic evaluation of neonates with severe hyperbilirubinemia using transiently evoked otoacoustic emissions and auditory brainstem responses［J］. Laryngoscope，1999，109（12）:2005-2008.

［3］ 陳舜年，賁曉明，夏振偉.膽紅素腦病動(dòng)物模型制作與鑒定［J］.新生兒科雜志，1997，12（4）: 166-169.

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［7］ 第二軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室.常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦立體定位圖譜［M］.北京:科學(xué)出版社，1990:16-18.

［8］ 王平宇，朱治遠(yuǎn)，祁建，等.大白鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)基礎(chǔ)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1987:9-120.

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T he Experimental Study of Changes of CaM on Cochlear Nucleus and Hearing Damage in Hyperbilirubinemia Newborn Rats

LI Ke-fang
（Department of Otolaryngology， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

Objective To investigate the effects of hearing damage with hyperbilirubinemia and function approach of neuro-toxicity. Methods Sixty newborn seven days SD（Sprague Dawley） rats were divided into contral group（C） and experiment group（M）randomly. Auditory brainstem response（ABR）and concentration of bilirubin in blood and brain in every groups were examined respectively. CaM immunohistochemistry dye were done in cochlear nucleus slices. Result ABR reflecting threshold obviously increases of group M after using medicine， Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ wave delitescence obvious extend. The average gray value of cochlear nucleus CaM in group M are obviously lower than group C. Conclusion CaM activation rising play an important role in hearing damage in hyperbilirubinemia.

Hyperbilirubinemia； CaM； Auditory brainstem response； Hearing damage

R589.9

B

1671-8194（2015）13-0006-02