劉小青，王亞軍，沈偉良，羅 希，鄭裕國

浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014

6-氰基-(3R,5R)二羥基己酸叔丁酯合成的補料生物轉(zhuǎn)化工藝

劉小青，王亞軍，沈偉良，羅 希，鄭裕國

浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014

通過對羰基還原酶工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-cr與葡萄糖脫氫酶工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-gdh的全細(xì)胞協(xié)同生物轉(zhuǎn)化工藝進行優(yōu)化，實現(xiàn)高濃度投料的6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-CHOHB]不對稱還原合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-CDHHB]。采用全細(xì)胞分批轉(zhuǎn)化方式，確定底物(5R)-CHOHB和葡萄糖的一次性投料濃度為300 g/L。進一步考察了補料轉(zhuǎn)化方式對提高轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，相對于一次性投料的全細(xì)胞分批轉(zhuǎn)化工藝，采用連續(xù)補料方式和分批補料方式均能使底物投料量達(dá)到400 g/L。相對于以往報道，底物投料量提高了33.3%，產(chǎn)物(3R,5R)-CDHHB非對映體過量值（d.e.值）為99.5 %，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

補料生物轉(zhuǎn)化 羰基還原酶 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯

阿托伐他汀是臨床上治療高血脂癥的首選藥物[1]，作為甲羥戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能有效抑制HMG-CoA向甲羥戊酸的還原性轉(zhuǎn)化，降低了低密度脂蛋白膽固醇的水平，達(dá)到降低血脂的目的[2,3]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-CDHHB]是合成阿托伐他汀的關(guān)鍵手性中間體[4]，含有兩個手性中心?；瘜W(xué)法合成(3R,5R)-CDHHB需要使用易燃試劑硼烷[5]，且差向選擇性誘導(dǎo)不充分，產(chǎn)物光學(xué)純度低。生物催化具有高對映體選擇、高區(qū)域選擇性以及環(huán)保低耗的優(yōu)勢，在倡導(dǎo)綠色環(huán)保低碳節(jié)能的大趨勢下，采用生物催化技術(shù)合成(3R,5R)-CDHHB具有優(yōu)勢[6,7]。

羰基還原酶來源廣泛，是一種具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性的生物催化劑，常用于生物還原前手性酮制備手性醇[8]。近幾年來，用羰基還原酶作為生物催化劑參與合成(3R,5R)-CDHHB的研究與工業(yè)應(yīng)用日益增多，曹政等[9]在研究中所用底物(5R)-CHOHB質(zhì)量濃度達(dá)到了200 g/L，且底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)物非對映體過量值（d.e.）大于99.5%。本課題組前期已經(jīng)成功開發(fā)了羰基還原酶工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-cr與葡萄糖脫氫酶工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-gdh雙菌破碎液協(xié)同催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-CHOHB]選擇性還原合成(3R,5R)-CDHHB的技術(shù)[9-11]，如圖1所示。由于細(xì)胞內(nèi)源性NADP+足夠滿足反應(yīng)要求，該工藝無需添加外源性輔酶II，然而，細(xì)胞破碎處理增加了酶制備的操作成本，且會降低酶的穩(wěn)定性。同時，在有機溶劑/水兩相中進行的微生物催化反應(yīng)，有機溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)的一個重要障礙是有機溶劑一般都對微生物有明顯的毒害作用。de Snett等[12]在研究有機溶劑對大腸桿菌的影響中發(fā)現(xiàn)，在一定濃度有機溶劑存在情況下，細(xì)胞膜會從片層的雙層狀態(tài)變成蜂窩狀，顯然，有機溶劑的介入對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成了影響，破壞了其完整性?？紤]到以上涉及到的因素，本研究考察雙菌全細(xì)胞協(xié)同催化的可行性，并適時建立(3R,5R)-CDHHB的補料生物轉(zhuǎn)化工藝。

圖1 (3R,5R)-CDHHB生物轉(zhuǎn)化合成[9]Fig.1 Bioconversion asymmetric reduction of (5R)-CHOHB to (3R,5R)-CDHHB[9]

1 材料及方法

1.1 菌株和主要試劑

E. coliBL21/pET28a-cr與E. coliBL21/pET28a-gdh，由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建、保藏?？敲顾刭徸訲aKaRa公司；底物(5R)-CHOHB（質(zhì)量含量66.0%），新東港藥業(yè)贈送；(3R,5R)-CDHHB購自Toronto Research Chemicals Inc（多倫多，加拿大）；進口胰蛋白酶和進口酵母粉購自O(shè)xoid公司；其他化學(xué)試劑均為市售分析純試劑，其他培養(yǎng)基原料均為市售生化試劑。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基，采用LB固體培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基，組成：10 g/L進口胰蛋白胨，5 g/L進口酵母粉，10 g/L NaCl。培養(yǎng)基滅菌后加入終濃度30 μg/mL卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：15 g/L甘油，15 g/L蛋白胨（國產(chǎn)），12 g/L酵母粉（國產(chǎn)），10 g/L NaCl，5 g/L (NH4)2SO4，1.36 g/L KH2PO4，2.28 g/L K2HPO4·3H2O，0.375 g/L MgSO4·7H2O。培養(yǎng)基滅菌后加入終濃度30 μg/mL卡那霉素。

1.2.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基中挑取一接種環(huán)的菌落接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床（37 ℃，150 r/min）培養(yǎng)7～8 h。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：配制3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，按照說明安裝好pH電極與溶氧電極等附件，實消滅菌（121 ℃，20 min）后，加卡那霉素至終濃度30 μg/mL。按接種量3%接種后，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量0.24 m3/h（通氣比約為1.33 vvm），罐壓0.05 MPa，發(fā)酵過程中用氨水和磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值維持在7.0左右。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37 ℃，當(dāng)菌體生長到對數(shù)生長期（發(fā)酵液細(xì)菌細(xì)胞光密度OD600為10～15）后，28 ℃降溫誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中定時取樣，一部分用于測定發(fā)酵液OD600，另一部分離心后收集菌體細(xì)胞用于測定酶活。當(dāng)OD600開始下降后，終止發(fā)酵，離心收集菌體。

1.3 全細(xì)胞催化合成(3R,5R)-CDHHB

反應(yīng)體系為100 mL（6.5 g/L三乙醇胺緩沖體系），10 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-cr，5 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-gdh，所用底物與葡萄糖的起始質(zhì)量濃度相同（終濃度為0～400 g/L）。在轉(zhuǎn)化過程中利用梅特勒雙通道恒pH滴定儀控制蠕動泵，通過滴加1.0 mol/L Na2CO3溶液來控制轉(zhuǎn)化液pH值在7左右，反應(yīng)溫度30 ℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min。定時取樣，樣品用無水乙醇稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后12 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm微濾膜過濾，透過液采用高效液相色譜分析。

1.4 全細(xì)胞催化制備(3R,5R)-CDHHB的補料工藝

1.4.1 分批轉(zhuǎn)化

初始反應(yīng)體系100 mL（6.5 g/L三乙醇胺緩沖體系），10 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-cr，5 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-gdh，(5R)-CHOHB與葡萄糖的質(zhì)量濃度相同（終濃度均為300 g/L）。設(shè)置兩種不同的補料料液組成：基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液中(5R)-CHOHB、葡萄糖的濃度均為100 g/L，反應(yīng)過程中每隔1 h補料100 g/L (5R)-CHOHB、葡萄糖；基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液中一次性投入300 g/L葡萄糖，反應(yīng)過程中每隔1 h補料100 g/L (5R)-CHOHB、葡萄糖。轉(zhuǎn)化反應(yīng)在30 ℃，pH 7.0條件下轉(zhuǎn)化8 h。

1.4.2 分批補料轉(zhuǎn)化

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液體積100 mL（6.5 g/L三乙醇胺緩沖體系），10 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-cr，5 g DCW/LE.coliBL21/pET28a-gdh，100 g/L (5R)-CHOHB，100 g/L 葡萄糖，轉(zhuǎn)化溫度30 ℃，轉(zhuǎn)化液pH值7.0。當(dāng)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上時，投入(5R)-CHOHB、葡萄糖（終濃度均為100 g/L）；當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上時，開始下一次投料。

1.4.3 連續(xù)補料轉(zhuǎn)化

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液組成及反應(yīng)條件同上。當(dāng)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上時，在4 h內(nèi)勻速泵入(5R)-CHOHB和葡萄糖溶液，兩者終濃度均為400 g/L。

1.5 分析方法

采用島津HPLC LC-20AD高效液相色譜法測定(5R)-CHOHB與產(chǎn)物(3R,5R)-CDHHB及其異構(gòu)體(3S,5R)-CDHHB濃度。選擇J&K CHEMICA C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），流動相組成為乙腈與水的體積比1:3，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長210 nm，進樣量20 μL，柱溫40 ℃。(5R)-CHOHB與產(chǎn)物(3R,5R)-CDHHB、(3S,5R)-CDHHB保留時間分別為11.5，7.8，7.4 min。

底物(5R)-CHOHB轉(zhuǎn)化率η(%)以質(zhì)量濃度計算(g/L)；產(chǎn)物(3R,5R)-CDHHB非對映體過量值（d.e.值）為(3R,5R)-CDHHB的峰面積和(3S,5R)-CDHHB的峰面積之差與兩者峰面積之和的比值。實驗過程中測得各反應(yīng)液產(chǎn)物 (3R,5R)-CDHHB的d.e.值均為99.5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 全細(xì)胞分批轉(zhuǎn)化合成(3R,5R)-CDHHB

圖2 底物濃度對(5R)-CHOHB分批轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of the substrate concentration on the conversion efficiency of (5R)-CHOHB under the batch bioconversion mode

圖2所示為底物濃度對(5R)-CHOHB全細(xì)胞分批轉(zhuǎn)化效率的影響。可以看到，100 g/L (5R)-CHOHB在1 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化；底物濃度增加至200 g/L、300 g/L時，轉(zhuǎn)化時間分別延長至4 h和7 h。當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃笾?50 g/L時，反應(yīng)到9 h達(dá)到平臺期，底物轉(zhuǎn)化率僅為19.6%；當(dāng)?shù)孜餄舛冗M一步增大到400 g/L時，反應(yīng)7 h后底物不再被還原，底物轉(zhuǎn)化率僅為3.5%。有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對有機溶劑耐受性比革蘭氏陽性菌強[13]，有機溶劑深層次的毒害是由它在細(xì)胞膜中濃度大小決定的[14]?？梢越忉尀椋倭康娜軇┓肿舆M人細(xì)胞膜內(nèi)并不足以破壞整個細(xì)胞，只有濃度達(dá)到一定限度超過了界限濃度，就會對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，影響其作為屏障和轉(zhuǎn)換的功能。因此，綜合考慮有機溶劑影響以及時空產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝時，分批轉(zhuǎn)化底物與葡萄糖投料量控制在300 g/L水平。

2.2 補料物料組成對分批補料轉(zhuǎn)化效率的影響

底物分批投料是提高催化反應(yīng)效率的有效措施[15]。首先考察了補料物料組成對(5R)-CHOHB分批補料轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果見圖3。實驗結(jié)果顯示，相比于300 g/L (5R)-CHOHB催化底物和300 g/L葡萄糖一次性投料的分批轉(zhuǎn)化方式，兩種補料物料組成下的補料方式均提高(5R)-CHOHB轉(zhuǎn)化速率，且底物均能完全轉(zhuǎn)化。其中，(5R)-CHOHB與葡萄糖同時等量補料情況下的底物轉(zhuǎn)化速率最快。

圖3 補料物料組成對(5R)-CHOHB轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effect of feed composition on (5R)-CHOHB stereoselective reduction

2.3 (3R,5R)-CDHHB分批補料轉(zhuǎn)化進程

分批補料模式下的(5R)-CHOHB轉(zhuǎn)化進程曲線示于圖4。如圖4所示，第1批底物在投料后40 min時完全轉(zhuǎn)化；第2批、第3批底物分別在總反應(yīng)時間2 h和4 h反應(yīng)完全，第4批底物在總反應(yīng)時間6 h完全轉(zhuǎn)化，此時(5R)-CHOHB累計投料400 g/L；投入第5批底物后，在總反應(yīng)時間9 h時轉(zhuǎn)化達(dá)到平衡，但底物轉(zhuǎn)化率下降至93%，這可能與高濃度(3R,5R)-CDHHB導(dǎo)致的產(chǎn)物抑制以及酶失活有關(guān)。相比于間隙轉(zhuǎn)化操作方式，分批補料轉(zhuǎn)化方式提高底物投料量33.3%。

圖4 分批補料對(5R)-CHOHB-還原反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of the fed-batch feeding on (5R)-CHOHB stereoselective reduction

圖5 連續(xù)補料與分批補料時的還原反應(yīng)結(jié)果Fig.5 Stereoselective reduction results under continuous feeding and fed-batch operations

2.4 (3R,5R)-CDHHB連續(xù)補料轉(zhuǎn)化

連續(xù)補料與分批補料都能有效提高催化反應(yīng)效率，圖5所示為兩種投料方式時(5R)-CHOHB生物還原結(jié)果?？梢钥闯?，在轉(zhuǎn)化前3 h內(nèi)，連續(xù)補料操作方式的反應(yīng)速率高于分批補料操作；隨著反應(yīng)進行，底物累計投料量增大、產(chǎn)物累積濃度增大，兩種操作方式對底物轉(zhuǎn)化速率的影響逐漸減??；轉(zhuǎn)化6 h，連續(xù)補料和分批補料操作兩種操作模式下400 g/L底物均能完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物d.e.值均保持在99.5%。依據(jù)以上結(jié)果，與本課題組前期工作以及相關(guān)研究報道[9-11]相比，底物投料量有很大提升，而且對于400 g/L的底物投料量，無論采用連續(xù)補料還是分批補料操作方式都能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求。

3 結(jié) 論

建立了重組大腸桿菌全細(xì)胞雙酶催化合成阿托伐他汀鈣的關(guān)鍵手性中間體(3R,5R)-CDHHB的催化工藝，高濃度的(5R)-CHOHB暴露破壞了E.coli細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高了(5R)-CHOHB、輔酶II和(3R,5R)-CDHHB的細(xì)胞通透性。全細(xì)胞分批催化工藝較細(xì)胞破碎液工藝節(jié)省了細(xì)胞破碎操作成本，提高了酶的儲存穩(wěn)定性。由于羰基還原酶存在底物抑制作用，進一步優(yōu)化了底物分批補料轉(zhuǎn)化和連續(xù)補料工藝，發(fā)現(xiàn)在(5R)-CHOHB累積投料量400 g/L條件下，反應(yīng)6 h底物均能完全轉(zhuǎn)化。與分批轉(zhuǎn)化工藝相比，補料轉(zhuǎn)化工藝提高時空產(chǎn)率33.3%，大幅度提高設(shè)備周轉(zhuǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

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Fed-Batch Bioconversion Process for Synthesis of t-Butyl-6-Cyano-(3R,5R)-Dihydroxylhexanoate

Liu Xiaoqing, Wang Yajun, Shen Weiliang, Luo Xi, Zheng Yuguo
Institute of Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

Process for synthesis oft-butyl-6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate [(3R,5R)-CDHHB] from asymmetric reduction oft-butyl-6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-carbonyhexanoate [(5R)-CHOHB] using whole cells of carbonyl producerE.coliBL21/pET28a-crtogether withE.coliBL21/pET28a-gdhwas developed in this work, with 300 g/L concentrations of (5R)-CHOHB and glucose respectively under the batch bioconversion mode. Furthermore, the effect of fed-bioconversion process of (3R,5R)-CDHHB was also investigated to improve the conversion efficiency. It was found that both the fed-batch and continuous feeding operation modes improved the conversion efficiency compared with batch intermittent conversion process, and raised the accumulated concentration of substrate loading up to 400 g/L, increased by 33.3% with respect to the previous report. Thed.e. value of (3R,5R)-CDHHB was 99.5%.

fed-bioconversion; carbonyl reductase;t-butyl-6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-carbonyhexanoate;t-butyl-6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate

1001—7631 ( 2015 ) 05—0443—06

Q555+.6

A

2015-04-07;

: 2015-05-21。

劉小青（1990—），女，碩士研究生；鄭裕國（1961—），男，教授，通訊聯(lián)系人。E-mail:zhengyg@zjut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金（21476209）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB710800）；省重大科技專項（2014C03010）。